別聰聰,李鋒民,李媛媛,趙雅菡,王震宇

(中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院,山東青島266100)

赤潮是1種全球性的海洋災害[1],自2000年以來,我國近海赤潮帶來約億元的直接經(jīng)濟損失[2]。目前赤潮的防治主要有人工打撈、播撒絮凝劑以及利用食物鏈除藻[3],各種方法顯示優(yōu)點的同時也有過度依賴人工、二次污染等缺點[4]。而化感作用的發(fā)現(xiàn)為赤潮的防治提供了新思路。

化感作用是指植物通過分泌次生代謝產物(化感物質)對其周圍的植物或微生物產生影響的現(xiàn)象[5-6]。化感作用在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的研究較為成熟,利用其進行作物輪作、間隙栽培等實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展已成為該領域的研究重點[7],但水生生態(tài)系統(tǒng)中的化感作用研究起步較晚,多處于實驗模擬階段。研究者驗證了陸生、水生植物對微藻的化感抑制作用[8-11],其中大型藻對微藻的生長影響現(xiàn)象近來受到關注,王悠等[12]發(fā)現(xiàn)大型藻石莼和江蘺完全殺死共培養(yǎng)的赤潮異彎藻,雷光英[13]發(fā)現(xiàn)龍須菜對海洋原甲藻產生生長抑制,這些研究使得利用大型藻化感作用防治赤潮成為可能。但赤潮爆發(fā)突然、范圍大,受大型藻培養(yǎng)周期長、作用范圍有限等因素的影響,利用活體大型藻防治赤潮的可行性不大,因此從大型藻中分離提取化感物質成為理想的手段,其不僅解決了大型藻的利用問題,而且大型藻來自海洋不易引起二次污染。

中肋骨條藻是全世界分布廣泛、我國近海發(fā)生頻率高且危害嚴重的典型赤潮藻[2,14],目前利用大型藻化感作用抑制中肋骨條藻的研究還較少見。因此本文選取孔石莼、羊棲菜、長滸苔、蜈蚣藻、馬尾藻和裙帶菜6種常見大型藻,比較其干粉末的海水浸提液對中肋骨條藻的化感抑制效果,篩選出具高抑藻能力的大型藻,并進行初步的化感物質分離,為進一步提取抑藻化感物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 大型藻 實驗采用的6種大型藻分別為孔石莼(Ulva pertusa)、羊棲菜(Sargassum fusiforme)、長滸苔(Enteromorpha clathrata)、馬尾藻(Sargassum pathen)、蜈蚣藻(Grateloupia filicina)和裙帶菜(Undaria pinnatifida),均購自浙江一泓藻業(yè)公司,自然風干。

1.1.2 中肋骨條藻 中肋骨條藻(Skeletonem a costatum)由中科院海洋所環(huán)境與生態(tài)實驗室提供。采用f/2(+Si)培養(yǎng)基[15],培養(yǎng)于人工智能光照培養(yǎng)箱中(寧波,江南儀器公司),光照強度為4000 Lx,晝夜時間與溫度分別為12/12 h和24/20℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 大型藻浸提液的制備 大型藻干燥(60℃,24 h)后,研缽研磨至粒徑小于0.1 mm,粉末密封待用。取30 g海藻干粉末,浸泡于250 m L經(jīng)0.45μm孔徑的醋酸纖維膜過濾且滅菌(121℃,20 min)的海水中,于25℃恒溫箱中避光浸提48 h。浸提液經(jīng)200目篩絹過濾,濾液再經(jīng)0.45μm孔徑的醋酸纖維膜過濾,最終濾液即為大型藻浸提液母液。采用單位體積大型藻的干重表示浸提液中大型藻的濃度。

1.2.2 長滸苔化感組分的萃取分離 稱取1 kg烘干(60℃,48 h)的長滸苔粉末于5 L無水乙醇中室溫浸泡提取48 h后,經(jīng)200目篩過濾獲得的乙醇浸提液,用旋轉蒸發(fā)儀(EYELA CCA-1110,Japan)在40℃下減壓蒸發(fā)濃縮,得到浸膏,浸膏按圖1所示步驟進行液液萃取分離,得到4個長滸苔的分離組分A、B、C和D。

圖1 長滸苔中化感物質的液液萃取分離步驟Fig.1 Extractive p roceduresof allelochemicals from E.clathrata

1.2.3 浸提液及化感組分抑藻活性檢測 取生長狀況良好、處于指數(shù)增長期的中肋骨條藻種液與已滅菌的海水f/2(+Si)培養(yǎng)基以1∶3(V/V)混合,充分搖勻。準確移取微藻培養(yǎng)液到體積為250 mL已高溫滅菌(121℃,20 min)的錐形瓶中,并按照0,0.5,1,2,4,8 m L的體積分別移取大型藻浸提液母液于已上述藻液中,最終藻液體積為200 mL,且大型藻的濃度分別為0,0.3,0.6,1.2,2.4,4.8 g/L。實驗設3個重復。每24 h測定中肋骨條藻的密度,根據(jù)藻的生長周期,實驗持續(xù)7 d。

大型藻浸提液的萃取分離組分均按上述步驟進行抑制實驗。

1.3 分析測試方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分析 每24 h采樣1 m L,經(jīng)Lugol’s試劑固定后,用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下(Nikon,YS-100)計數(shù)藻細胞數(shù)量的變化。通過比較6種大型藻對中肋骨條藻的抑制率IR(%)±SD和半效應濃度EC50±SD值來評價大型藻對中肋骨條藻抑制能力強弱。

抑制率計算公式:IR(%)=(1-N/N0)×100%,N0為微藻單獨培養(yǎng)時細胞密度(對照組),N是投加大型藻后的微藻細胞密度(處理組)。

大型藻對微藻的半效應濃度EC50值采用內插直線法計算[16]。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件完成。

1.3.2 化感組分的結構分析 實驗采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)Aglient2006分析化感組分的結構,其中色譜柱型號為HP-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),程序升溫條件:60℃(5 min),60℃升溫至280℃(5℃/min),280℃(2 min);注射口溫度280℃。M S條件:離子源-70 ev,溶劑延遲時間4 min。

2 結果與討論

2.1 大型藻浸提液對中肋骨條藻生長的影響

孔石莼、羊棲菜、長滸苔、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜6種大型藻浸提液均能影響中肋骨條藻的生長,其生長曲線的變化如圖2。6種受試海藻浸提液對中肋骨條藻的抑制率隨濃度的增大而提高,當濃度達到1.2 g/L時,長滸苔對中肋骨條藻的抑制率達到50%,孔石莼、羊棲菜、長滸苔、馬尾藻和蜈蚣藻的浸提液在濃度達到2.4 g/L時可在實驗周期內使中肋骨條藻全部致死,抑制率達到100%,全部致死所需時間分別為96、120、96、144和144 h。而在大型藻濃度達到4.8 g/L時,6種大型藻均可全部殺死中肋骨條藻,使微藻全部死亡的時間,孔石莼、羊棲菜、長滸苔、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜分別為72、96、72、96、96、120 h,可見隨著大型藻濃度的增大,使中肋骨條藻全部死亡所需的時間變短。此外,在6種大型藻的低濃度(0.3 g/L)處理中,中肋骨條藻的生長被輕微的促進,如微藻培養(yǎng)至72 h時,長滸苔的0.3 g/L的濃度處理組,中肋骨條藻的抑制率為-18%,類似的促進中肋骨條藻生長的現(xiàn)象在馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜低濃度(0.3 g/L)處理中也同時出現(xiàn)。

王悠等[12]研究了新鮮石莼組織及其培養(yǎng)液濾液對赤潮異彎藻的生長影響。石莼鮮組織的起始濃度愈高,其對赤潮異彎藻生長的抑制作用愈明顯。而這種高濃度抑制微藻生長低濃度生長促進微藻生長的現(xiàn)象被成為“低促高抑”現(xiàn)象,其他研究者有類似的發(fā)現(xiàn)。南春容等[17]發(fā)現(xiàn):孔石莼浸提液濃度為2 g/L時,赤潮異彎藻在2 d內能完全被殺死,至第7天,中肋骨條藻能完全致死。但是當處理濃度為0.25和0.50 g/L時,2種微藻細胞均從第5天起也出現(xiàn)迅速增殖,至實驗結束藻細胞密度大于對照組,表現(xiàn)為促進效應。

本研究表明,6種大型藻浸提液能抑制中肋骨條藻的生長,且濃度越大抑制效果越顯著,長滸苔的抑制能力最強,EC50值為1.0 g/L,結合抑制率曲線,2.4 g/L是其抑制中肋骨條藻赤潮的可選用的濃度。

圖2 6種大型藻浸提液對中肋骨條藻的抑制率曲線Fig.2 The inhibito ry rate curve of 6 speciesmacroalgal seawater extract on S.costatum grow th

2.2 大型藻浸取液對中肋骨條藻生長的EC50值比較

采用直線內插法計算長滸苔、孔石莼、羊棲菜、馬尾藻、蜈蚣藻和裙帶菜浸提液對中肋骨條藻的EC50,120h值分別為1.0、1.0、1.1、1.4、2.5和4.7 g/L(見圖3)。裙帶菜的EC50值最高,為4.7 g/L,其抑制中肋骨條藻生長的能力最弱。長滸苔和孔石莼的EC50最低,結合抑制率結果可以看出,長滸苔和孔石莼對中肋骨條藻的抑制能力最強。相比孔石莼,長滸苔對微藻的化感抑制作用研究相對較少,因此后續(xù)的研究中選取長滸苔進行進一步的化感組分的分離。

圖3 6種大型藻對中肋骨條藻的半效應濃度EC50(g/L)Fig.3 The EC50(g/L)valuesof 6 speciesmacroalgae on S.costatum

半效應濃度EC50是表征抑制劑抑制目標生物能力的指標,EC50值越小,說明抑制劑的抑制作用越強。發(fā)表的研究結果顯示不同的大型藻對不同的目標微藻抑制能力不同,如石莼干組織對中肋骨條藻的EC50值為0.5 g/L[17],孔石莼有性株干粉末對赤潮異彎藻和塔瑪亞歷山大藻的EC50值分別為1.0、0.8 g/L[18]。與本研究相比,長滸苔對中肋骨條藻的EC50值為1.0 g/L,顯示了較強的抑制能力。本研究中不同的大型藻的干粉末浸提液對同種赤潮藻細胞表現(xiàn)出的不同的生長抑制作用(生長抑制率和半效應濃度)表明中肋骨條藻細胞對不同的大型藻有不同的敏感性。Sanna等[19]認為1種生物體的敏感性取決于該種生物對其所暴露的化感物質的自然屬性,同一物種可能對來源不同的化感物質有不同的反應。

目前大部分的研究采用浸提液、濾液[17,20]或胞外分泌物[21]進行,但是能確定并分離到化感物質對于進一步研究化感作用的本質、化感物質的釋放、對目標種生理生化的影響,以及化感物質在水體中的遷移都是至關重要的,有研究者試圖進行這樣的研究,有的能成功[22],有的卻未果[23],這也是1個制約化感作用研究的難點。因此,長滸苔抑制中肋骨條藻的生長的作用機理的深入研究以及進一步的應用需要更進一步的化感物質的提取。

2.3 長滸苔化感組分對中肋骨條藻生長的影響

長滸苔浸提液經(jīng)液液萃取分離后得到4個化感組分A、B、C和D,其對中肋骨條藻的生長影響如圖4。在培養(yǎng)3 d內,組分A最大抑制率僅為39%。對于組分B,隨濃度的增大對中肋骨條藻生長的抑制率增大,濃度為0.2 mg/L時,在第1天抑制率就幾乎達到了60%,至第2天,0.1、0.2、0.4 m g/L濃度處理的抑制率分別為63%、73%和84%,在第3天,0.4 mg/L處理組的抑制率分別達到96%,幾乎完全殺死了藻細胞。組分C和D在3 d培養(yǎng)中最大抑制不超過40%?？梢钥闯?組分B的抑藻效果最好。

圖4 4個液液萃取組分對中肋骨條藻生長72 h的抑制率Fig.4 Inhibito ry rate curve of 4 extractive parts on S.costatum in 72 hours

4個組分對中肋骨條藻的抑制率所得EC50·72h值如表3所示,組分B的EC50最小,為0.08 mg/L。半效應濃度值越低表明其抑制50%藻生長所需濃度越低,抑藻效果越好。該結果與抑制率結果相符,組分B具有最好的抑藻效果。

表3 長滸苔4個化感組分的EC50,72hTable 3 EC50,72h of 4 extractive parts on S.costatum

當前已報道的化感物質,槐糖酯、沒食子酸抑制亞歷山大藻的EC50值大約在10～20 m g/L間[24-25],兒茶酚、對苯二酚的抑藻效果較好,其對銅綠微囊藻的EC50值分別約為0.3、0.059 mg/L[26-27]。盧慧明研究發(fā)現(xiàn)大型藻龍須菜的乙醇浸出組分對中肋骨條藻的EC50值為42 mg/L[28],但是沒有對其做進一步的分離。本研究中組分B對中肋骨條藻的EC50值為0.08 mg/L,顯示了很強的抑藻活性。因此,在后續(xù)的研究中采用GC-M S分析組分B中所含物質的結構,找出可能的起作用的化感物質。

3.3.3 化感組分的結構分析 為確定長滸苔中抑藻化感物質的結構,對液液萃取所得4個組分中抑藻效果顯著的組分B采用GC-M S分析其中的物質結構,所得色譜圖如圖5所示,利用M S得到各峰對應的化學物質名稱如表5所示。組分B有9個色譜峰(見圖5),其中含量最高的3個組分以名稱(化學式,保留時間,含量)表示分別為:9-十八炔(C18H34,15.73 min,28.45%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(C16H22O4,16.34 min,18.58%)、17-烯/十八醛(C18H36O,16.57 min,11.18%)。但是,哪種或哪幾種物質是有效的化感物質,仍需進一步研究。

圖5 乙酸乙酯萃取組分B的氣相峰譜圖Fig.5 GC chromatogram of the part B

表5 乙酸乙酯萃取組分B的質譜結構分析結果Table 5 Mass results obtained from GC-MSanalysis of the fraction B

3 結語

6種大型藻抑制中肋骨條藻的EC50由小到大依次為:孔石莼1.0 g/L、長滸苔1.0 g/L、羊棲菜1.1 g/L、馬尾藻1.4 g/L、蜈蚣藻1.5 g/L,裙帶菜4.7 g/L。根據(jù)抑制率和半效應濃度2個評價指標,孔石莼和長滸苔對中肋骨條藻的抑制能力最強,其使中肋骨條藻全部致死的浸提液濃度為2.4 g/L。對長滸苔浸提液進行了液液萃取分離,得到具有強抑藻活性的組分即乙酸乙酯萃取相,采用GC-M S初步分析了物質結構,但其化感物質還需進一步分離和鑒定。本研究為長滸苔的開發(fā)利用和從中提取分離化感物質進行赤潮防治提供了科學基礎。

[1] Sandra E Shumway,Steven M Allen,Boersma P Dee.Marine birds and harm ful algal bloom s,sporadic victims or under-reported events[J]?Harmful Algae,2003(2):1-17.

[2] 中國國家海洋局.2009年中國海洋環(huán)境質量公報[Z].北京:國家海洋局,2010.

[3] 趙玲,尹平河,李坤平,等.摻銅可溶玻璃微粒去除海洋原甲藻赤潮生物的研究[J].海洋環(huán)境科學,2001,20(1):7-11.

[4] 周名江,于仁成.有害赤潮的形成機制、危害效應與防治對策[J].自然雜志,2007,29(2):72-77.

[5] Molish H.Der Einfluss einer Pflanze die andere-A llelopathie[M].[s.l.]:Fischer Jena,1937.

[6] Rice E L.Allelopathy[M].2ndedition.London:Academic Press.1984.

[7] Harminder P Singh,Daizy R Batish,Ravinder K Kohli.Allelopathic effect of two volatile monoterpenes against bill goat weed(Ageratum conyzoides L.)[J].Crop Protection,2002,21:347-350.

[8] 徐永健,錢魯閩,焦念志.添加大型海藻龍須菜對中肋骨條藻赤潮的影響[J].臺灣海峽,2005,24(4):532-539.

[9] Wang Renjun,Xiao Hui,Wang You,et al.Effectsof threemacroalgae,U lva linza(Chlorophyta),Corallina pilulifera(Rhodophyta)and Sargassum thunbergii(Phaeophyta)on the grow th of the red tidemicroalga Prorocentrum donghaiense under laboratory conditions[J].Journal of Sea Research,2007(58):189-197.

[10] 張余霞,張玲,張陽陽,等.鹽京九號水稻秸稈對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制作用[J].生態(tài)與農村環(huán)境學報,2008,24(3):60-63.

[11] 李鋒民,胡洪營,種云霄,等.蘆葦化感物質EMA對銅綠微囊藻生理特性的影響[J].中國環(huán)境科學,2007,27(3):377-381.

[12] 王悠,俞志明,宋秀賢,等.共培養(yǎng)體系中石莼和江蘺對赤潮異彎藻生長的影響[J].環(huán)境科學,2006,27(2):246-252.

[13] 雷光英,楊宇峰,李宵.龍須菜對赤潮異彎藻和海洋原甲藻的生長抑制效應[J].海洋環(huán)境科學,2010,29(2):27-31.

[14] 徐家聲.近海蝦池與赤潮[M].第1版.北京:海洋出版社,2003:27-28.

[15] Guillard R R L,Ryther J H.Studies on marine planktonic diatoms.I.Cyclotella nana(Hustedt)and Detonula confervacea(Cleve)[J].Can J Microbiol,1962,8:229-239.

[16] 周永欣,章宗涉.水生生物毒性試驗方法[M].北京:農業(yè)出版社.1989:109-133.

[17] Nan Chunrong,Zhang Haizhi,Lin Shaozhen,et al.Allelopathic effects of Ulvalactuca on selected species of harmful bloom-forming microalgae in laboratory cultures[J].Aquatic Botany,2008,89:9-15.

[18] JIN Qiu,DONG Shuanglin.Comparative studies on the allelopathic effects of two different strains of Ulva pertusa on Heterosigma akashiwo and A lexandrium tamarense[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2003,293:41-55.

[19] Sanna Suikkanen,Giovana O Fistarol,Edna Granéli.Allelopathic effects of the Baltic cyanobacteria Nodularia spum igena,A phanizomenon flos-aquae and Anabaena lemmermannii on algal monocultures[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2004,308:85-101.

[20] Urban Tillmann,Uwe John,Allan Cembella.On the allelochemical potency of themarine dinoflagellate Alexandrium ostenfeldii against heterotrophic and autotrophic protists[J].Journal of Plankton Research.2007,29(6):527-543.

[21] Emily K Prince,Tracey L Myers.Effects of harmful algal bloomson competitors:allelopathic mechanisms of the red tide dinoflagellate Karenia brevis[J].Limnology and Oceanography,2008,53(2):531-541.

[22] Li Feng-Min,Hu Hong-Ying.Isolation and characterization of a novel antialgal allelochemical from Phragm ites communis[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(11):6545-6553.

[23] Emily K Prince,Kelsey L Poulson,Tracey L Myers,et al.Characterization of allelopathic compounds from the red tide dinoflagellate Karenia brevis[J].Harmful Algae,2010,10:39-48.

[24] Sun Xiao-Xia,Choi Joong-Ki,Kim Eun-Ki.A preliminary study on the mechanism of harmful algal bloom mitigation by use of sophorolipid treatment[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2004,304:35-49.

[25] 楊維東,張信連,劉潔生.酚酸類化感物質對塔瑪亞歷山大藻生長的影響[J].中國環(huán)境科學,2005,25(4):417-419.

[26] Francisco A Macías,Ascensión Torres,JoséL G Galindo,et al.Bioactive terpenoids from sunflower leaves cv.Peredovick?[J].Phytochemistry,2002,61:687-692.

[27] 丁惠君,張維昊,周偉斌,等.兩種酚酸類化感物質對銅綠微囊藻生長的影響[J].環(huán)境科學與技術,2007,30(7):1-3.

[28] 盧慧明,廖小建,楊宇峰,等.大型海藻龍須菜浸出組分對中肋骨條藻的化感抑制作用[J].生態(tài)科學,2008,27(5):424-426.