韓寶芹,王 劍,蔡文娣,宋福來,劉萬順

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊261053)

糖尿病(Diabetes mellitus)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病,長期的碳水化合物、脂肪以及蛋白質(zhì)代謝紊亂可導(dǎo)致多組織慢性進(jìn)行性病變、功能減退甚至器官衰竭[1]。甲殼素是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵的形式連接而成的聚合物,殼聚糖為其脫乙酰產(chǎn)物。已有文獻(xiàn)報道,低分子量殼聚糖[2-4]、甲殼低聚糖[5]、殼寡糖[6]對糖尿病大鼠血糖均有調(diào)節(jié)作用。鑒于低分子量殼聚糖的水溶性較好,以及不同化學(xué)修飾的低分子量殼聚糖生物活性不同,本研究對低分子量水溶性殼聚糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和分子量測定,研究了其對糖尿病大鼠的血糖調(diào)節(jié)作用,并初步探討其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性W istar大鼠50只,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(清潔級,許可證號SCXK魯20050017),體質(zhì)量(200±20)g。大鼠飼養(yǎng)條件:飲食飲水供應(yīng)充足,每12 h更換潔凈塑料鼠籠,室溫在18～22℃,光照周期為12 h明亮、12 h黑暗,室內(nèi)通風(fēng)良好,氨濃度小于20 ppm,相對濕度為40%～70%。適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 材料、試劑與儀器

低分子量殼聚糖、低分子量羧甲基殼聚糖、低分子量羧甲基甲殼素(本實驗室制備)。

分子量180～84 400 Da右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);鏈脲佐菌素(Strep tozotoccin,STZ,美國Sigma公司);血糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);糖原測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);TU-1800紫外分光光度計(北京普析通用有限責(zé)任公司);Waters 1525型液相色譜儀、2414型示差折光檢測器(美國Waters公司);Eclipse E200生物顯微鏡(日本尼康有限公司);PowerShot A 650 IS數(shù)碼相機(日本佳能公司)。

1.3 方法

1.3.1 水溶性低分子量殼聚糖分子量的測定 采用高效液相色譜分析法測定分子量(Mw)。色譜條件為:色譜柱:Shodex Ohpak SB-806M HQ;流動相:1 mol/L Na2SO4水溶液;柱溫:25℃;流速:1 m L/min;進(jìn)樣量20μL;2414型示差折光檢測器檢測。

對分子量為4 600、7 100、10 000、21 100和84 400 Da的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相色譜分析,建立峰位時間與其對應(yīng)分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對水溶性低分子量殼聚糖進(jìn)行高效液相色譜分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定其分子量。

1.3.2 水溶性低分子量殼聚糖乙?；c羧甲基取代度的測定 采用電位滴定法測定水溶性低分子量殼聚糖乙酰基和羧甲基取代度。精確稱取低分子量水溶性低分子量殼聚糖0.100 0 g(準(zhǔn)確至0.000 2 g),加入15 mL 0.3 mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液,攪拌至完全溶解。用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液在攪拌下滴定,用數(shù)字酸度計測定溶液p H值,直到p H>11時終止滴定,記錄p H值和消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積,用一階微商法找出突躍點。另取一份水溶性低分子量殼聚糖,置于105℃烘干至恒重,測定干燥失重。參照文獻(xiàn)[7-8],計算水溶性低分子量殼聚糖乙?；c羧甲基取代度。

1.3.3 糖尿病大鼠模型的建立 建模大鼠禁食不禁水12 h以上,按65 mg/kg體質(zhì)量一次性腹腔注射無菌1%STZ檸檬酸鈉緩沖液(p H=4.32),正常組大鼠按體質(zhì)量注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液。注射7 d后,禁食不禁水5 h,尾靜脈采血測定空腹血糖值(Fasting p lasma glucose,FPG),半定量法測定尿糖,以血糖≥10 mmol/L、尿糖≥+++,并出現(xiàn)多飲、多食、多尿等現(xiàn)象為造模成功。

1.3.4 動物分組及實驗方法 正常組(Normal):正常大鼠9只,按體質(zhì)量每日灌胃蒸餾水5 m L/kg;模型組(DM model):造模大鼠9只,按體質(zhì)量每日灌胃蒸餾水5 m L/kg;低分子量殼聚糖組(LMC):造模大鼠9只,按體質(zhì)量每日灌胃低分子量殼聚糖180 m g/kg;低分子量羧甲基殼聚糖(LM-CMC):造模大鼠9只,按體質(zhì)量每日灌胃低分子量羧甲基殼聚糖180 mg/kg;低分子量羧甲基甲殼素組(LM-CMCT):造模大鼠9只,按體質(zhì)量每日灌胃羧甲基甲殼素180 mg/kg。每天稱質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整劑量,連續(xù)灌胃45 d。

1.3.5 一般狀態(tài)觀察 觀察大鼠健康以及活動狀況,飲食、飲水是否正常,記錄體質(zhì)量。

1.3.6 空腹血糖 于末次灌胃后,大鼠禁食不禁水5 h,尾靜脈采血,采用試劑盒法測定空腹血糖。

1.3.7 糖耐量實驗(O ral glucose tolerance test,OGTT) 45 d后,大鼠禁食不禁水5 h,各實驗組分別給予相同濃度水溶性低分子量殼聚糖,模型組給予同體積蒸餾水,20 min后,各組大鼠分別按體質(zhì)量2.0 g/kg灌胃葡萄糖,分別于灌胃葡萄糖后第0、0.5、2 h測定血糖值(Plasma glucose,PG)計算各組大鼠各時間點血糖曲線下面積(AUG)的變化。

糖耐量曲線下面積=1/2×(PG0h+PG0.5h)×0.5+1/2×(PG2h+PG0.5h)×1.5

1.3.8 肝糖原和肌糖原含量的測定 所有大鼠于末次灌胃后處死,分別取肝臟組織75 mg,肌肉組織85 mg于試管中,按比例加入一定體積堿液,沸水浴煮20 min,流水冷卻,加蒸餾水稀釋后,試劑盒法測定肝糖原、肌糖原含量。

1.3.9 病理組織切片觀察 所有大鼠于末次灌胃后處死,取新鮮胰腺組織,肉眼觀察是否有病變,取接近胰尾部分固定,脫水,透明,制成7μm石蠟切片,經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察組織學(xué)變化,拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,各組數(shù)據(jù)均以SE)表示,組間比較采用Duncan’s法,以P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 水溶性低分子量殼聚糖的分子量測定

經(jīng)高效液相色譜分析,以不同分子量右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)樣分離的保留時間與其對應(yīng)的分子量值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Ln(M n)=14.092 28-0.509 7305*T,相關(guān)系數(shù)為0.995 875 5,方差為0.073 167 69。

水溶性低分子量殼聚糖分子量測定結(jié)果見表1。

2.2 水溶性低分子量殼聚糖表征的測定

電位滴定法測定樣品的乙?；〈汪燃谆〈?結(jié)果見表1。

表1 水溶性低分子量殼聚糖的分子量、脫乙酰度及取代度Table 1 Molecular acetyl,carboxymethyl degree of water-soluble low molecular chitosan

2.3 動物實驗結(jié)果

2.3.1 一般狀態(tài)觀察 與正常大鼠比較,糖尿病大鼠造模后出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,體毛松散,精神萎靡,活動量減少,體質(zhì)量降低(見表2)。與模型組相比較,各水溶性低分子量殼聚糖組大鼠體質(zhì)量有所增高,且在一定程度上改善了糖尿病大鼠上述癥狀。其中,低分子量羧甲基甲殼素組與模型組大鼠相比較,體質(zhì)量增長率為45.94%,有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響(n=9,E)Table 2 Effects of water-soluble low molecular chitosan on body weight in diabetic rats(n=9,SE)

表2 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響(n=9,E)Table 2 Effects of water-soluble low molecular chitosan on body weight in diabetic rats(n=9,SE)

注:與DM模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01。Compared with DM model group,*P<0.05,**P<0.01.

組別Group灌胃濃度Dose/mg·kg-1實驗前Befo re test/g實驗后After test/g增長率Increase/%正常組Normal—207.56±8.68 458.00±53.30**120.66模型組DM model—206.11±15.33 222.67±38.00 8.03低分子量羧甲基殼聚糖組LM-CMC 180 207.00±9.94 233.75±16.02 12.92低分子量殼聚糖組LMC 180 207.25±23.37 262.50±25.36 26.66低分子量羧甲基甲殼素組LM-CMCT 180 207.62±19.96 303.00±19.00**45.94

2.3.2 水溶性低分子量殼聚糖對大鼠空腹血糖的影響

模型組血糖在造模45 d后為(31.29±2.38)mmol·L-1,各水溶性低分子量殼聚糖組大鼠空腹血糖與模型組相比較有不同程度的降低,其中低分子量殼聚糖組大鼠空腹血糖為(22.58±1.79)mmol·L-1,低分子量羧甲基甲殼素組為(20.64±2.21)mmol·L-1,這兩組數(shù)據(jù)與模型組大鼠空腹血糖相比較有極顯著差異(P<0.01,見表3),說明低分子量殼聚糖和低分子量羧甲基甲殼素可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖水平。

表3 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠空腹血糖的影響(n=9,SE)Table 3 Effects of water-soluble low molecular chitosan on fasting p lasma glucose in diabetic rats(n=9,SE)

表3 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠空腹血糖的影響(n=9,SE)Table 3 Effects of water-soluble low molecular chitosan on fasting p lasma glucose in diabetic rats(n=9,SE)

注:與DM模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01。Compared with DM model group,*P<0.05,**P<0.01.

組別Group增長率Increase/%空腹血糖Fasting plasma glucose/mmol·L-1正常組Normal—6.69±0.97**6.71±0.84**0.30灌胃濃度Dose/mg·kg-1模型組DM model—20.31±3.25 31.29±2.38 54.06低分子量羧甲基殼聚糖組LM-CMC 180 19.41±3.33 28.31±2.71 45.85低分子量殼聚糖組LMC 180 19.50±3.38 22.58±1.79**15.79低分子量羧甲基甲殼素組LM-CMCT 180 18.57±2.13 20.64±2.21**11.10實驗前Before test實驗后After test

2.3.3 溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠糖耐量的影響 與模型組相比較,各實驗組大鼠在不同時相血糖值(PG)均有不同程度降低(見表4)。其中,低分子量殼聚糖組與模型組相比較,PG0h,PG0.5h,PG2.0h均有顯著降低(P<0.05),低分子量羧甲基甲殼素組與模型組相比較,PG0h,PG0.5h,PG2.0h降低極顯著(P<0.01)。

表4 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠糖耐量實驗各時相血糖值的影響(n=9,SE)Table 4 Effects of water-soluble low molecular chitosan on plasma glucose of each time phase of OGTT in diabetic rats(n=9,SE)

表4 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠糖耐量實驗各時相血糖值的影響(n=9,SE)Table 4 Effects of water-soluble low molecular chitosan on plasma glucose of each time phase of OGTT in diabetic rats(n=9,SE)

注:與DM模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01。Compared with DM model group,*P<0.05,**P<0.01.

組別Group灌胃濃度Dose/mg·kg-1血糖Plasma glucose/mmol·L-1 0小時0 h 0.5小時0.5 h 2小時2 h正常組Normal—7.11±0.80**9.12±0.70**7.56±1.18**模型組DM model—33.21±1.92 40.36±9.02 32.98±1.28低分子量羧甲基殼聚糖組LM-CMC 180 29.92±4.75 34.21±5.66 27.80±5.08低分子量殼聚糖組LMC 180 24.80±2.83*29.97±2.09**20.78±5.65**低分子量羧甲基甲殼素組LM-CMCT 180 19.89±4.03**26.91±3.31**23.37±7.56*

以模型組糖耐量曲線下面積(AUC)為100%計算,如表5所示,正常組糖耐量曲線下面積為22.59%,低分子量羧甲基殼聚糖組為85.20%,低分子量殼聚糖組為70.51%,低分子量羧甲基甲殼素組為67.32%,其中低分子量殼聚糖組與低分子量羧甲基甲殼素組有極顯著差異(P<0.01)。

通過糖耐量實驗中各實驗組的不同時相血糖值、糖耐量曲線下面積與模型組相比較,從結(jié)果可以看出,低分子量殼聚糖與低分子量羧甲基甲殼素可以明顯降低糖尿病大鼠的糖耐量,在機體攝入葡萄糖后快速降低血糖水平。

表5 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠糖耐量實驗曲線下面積的影響(n=9SE)Table 5 Effectsof water-soluble low molecular chitosan on AUC of OGTT in diabetic rats(n=9,SE)

表5 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠糖耐量實驗曲線下面積的影響(n=9SE)Table 5 Effectsof water-soluble low molecular chitosan on AUC of OGTT in diabetic rats(n=9,SE)

注:與DM模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01。Compared with DM model group,*P<0.05,**P<0.01.

組別Group灌胃濃度Dose/mg·kg-1糖耐量曲線下面積AUC/mmol·L-1曲線下面積百分?jǐn)?shù)AUC/%正常組No rmal—16.58±0.94**22.59模型組DM model—73.41±10.06 100低分子量羧甲基殼聚糖組LM-CMC 180 62.54±7.84 85.20低分子量殼聚糖組LMC 180 51.76±5.8**70.51低分子量羧甲基甲殼素組LM-CMCT 180 49.42±8.12**67.32

2.3.4 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠肝糖原和肌糖原的影響 由表6中得知,低分子量殼聚糖組肝糖原含量為(17.48±2.35)mmol·g-1,與模型組相比有極顯著提高(P<0.01)。低分子量羧甲基殼聚糖組與低分子量羧甲基甲殼素組大鼠肝糖原含量與模型組相比較也有所升高,但無顯著性差異。

水溶性低分子量殼聚糖各組大鼠肌糖原含量與模型組相比較有所增加,但無顯著性差異。

表6 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠肝糖原和肌糖原的影響(n=9,SE)Table 6 Effects of water-soluble low molecular chitosan on hepatic glycogen and muscular glycogen in diabetic rats(n=9,SE)

表6 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠肝糖原和肌糖原的影響(n=9,SE)Table 6 Effects of water-soluble low molecular chitosan on hepatic glycogen and muscular glycogen in diabetic rats(n=9,SE)

注:與DM模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01。Compared with DM model group,*P<0.05,**P<0.01.

組別Group灌胃濃度Dose/mg·kg-1肝糖原Hepatic glycogen/mmol·g-1肌糖原M uscle glycogen/mmol·g-1正常組Normal—20.54±6.11**2.05±0.53**模型組DM model—9.42±3.4 51.62±0.39低分子量羧甲基殼聚糖組LM-CMC 180 13.12±3.47 1.99±0.38低分子量殼聚糖組LMC 180 17.48±2.35**1.99±0.51低分子量羧甲基甲殼素組LM-CMCT 180 9.72±2.23 1.96±0.20

2.3.5 水溶性低分子量殼聚糖對糖尿病大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響 顯微觀察顯示,正常組大鼠胰島(見圖1A)呈球形細(xì)胞團(tuán),形狀規(guī)則,由結(jié)締組織膜包被,與外分泌部界限清楚。細(xì)胞核核仁清晰,胞漿豐富,胰島細(xì)胞邊緣整齊。糖尿病大鼠胰腺均有不同程度的病變,胰島數(shù)目明顯減少,萎縮或退化,伴有炎癥細(xì)胞侵潤,且與外分泌腺界限模糊,胰島細(xì)胞向外擴(kuò)散(見圖1B)。各治療組胰島形態(tài)較模型組有所改善,其中低分子量羧甲基殼聚糖組(見圖1C)胰島細(xì)胞數(shù)目減少,有細(xì)胞肥大現(xiàn)象;低分子量殼聚糖組(見圖1D)胰島細(xì)胞保留數(shù)目較多,有輕度纖維細(xì)胞增生;低分子量羧甲基甲殼素組(見圖1E)胰島邊緣輕度纖維化,其他與正常組差別不大。說明水溶性低分子量殼聚糖可以促進(jìn)受損胰島細(xì)胞修復(fù),可能有刺激胰腺細(xì)胞增殖的作用。

圖1 灌胃45 d后各組大鼠胰腺病理組織切片染色觀察Fig.1 Observation on pathologic tissue biop sy dyeing of rats pancreas in each group after fed 45 days later

3 討論

殼聚糖可以經(jīng)酶解形成低分子量殼聚糖和殼寡糖,也可以經(jīng)過化學(xué)修飾形成不同基團(tuán)衍生化產(chǎn)物,該產(chǎn)物既具有水溶性,同時具有殼聚糖的生物活性。已有較多關(guān)于殼聚糖、殼寡糖降低血糖作用、羧甲基殼寡糖[9]促進(jìn)大鼠胰島細(xì)胞生長、并能體外顯著促進(jìn)胰島細(xì)胞釋放胰島素等的報道。且Nordtveit等研究發(fā)現(xiàn)不完全脫乙酰度的殼聚糖較完全脫乙酰度的殼聚糖更容易被溶菌酶消化[10]。低分子量殼聚糖在腸胃中可以形成膠狀粘性纖維,降低腸道內(nèi)雙糖酶活性,延緩胃排空,降低糖吸收速度,增加周圍組織對胰島素的敏感性[11]。綜合已有文獻(xiàn),低分子量殼聚糖的調(diào)節(jié)血糖作用較高分子量殼聚糖調(diào)節(jié)血糖作用更好,不同結(jié)構(gòu)的低分子量殼聚糖對動物高血糖的調(diào)節(jié)作用可能不同。

糖原合成是機體儲存多余葡萄糖的一個重要途徑,胰島素可以通過激活糖原合成酶磷酸酶來促進(jìn)肝臟、肌肉中糖原的合成。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的肝糖原合成酶活性降低[12],本研究發(fā)現(xiàn),水溶性低分子量殼聚糖可以提高糖尿病大鼠肝糖原、肌糖原含量,提示其調(diào)節(jié)作用可能是通過提高機體對胰島素的敏感性,從而促進(jìn)糖原合成,降低血液中葡萄糖含量。

本實驗研究了3種不同化學(xué)修飾的水溶性低分子量殼聚糖對大鼠高血糖的影響,三者的分子量在10 000～25 000 Da。從分子結(jié)構(gòu)特征看,低分子量羧甲基殼聚糖與低分子量羧甲基甲殼素分子量相近,羧化度相當(dāng),但前者乙?；〈鹊?7.50%),后者乙?；〈雀?89.96%)。而低分子量殼聚糖則不含羧基,其乙酰基取代度(52.71%)介于低分子量羧甲基殼聚糖與低分子量羧甲基甲殼素之間。三者對血糖的調(diào)節(jié)作用相比較,羧甲基甲殼素降低血糖、改善糖耐量效果最好,低分子量殼聚糖效果次之,因此從分子結(jié)構(gòu)角度推測,水溶性低分子量殼聚糖的乙?；赡茉谔悄虿〈笫笱钦{(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。其調(diào)節(jié)血糖作用機理還有待進(jìn)一步研究。

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