李 娜,陸 海

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

1 植物APX的酶學(xué)特征與催化機(jī)制

植物因在光合作用時(shí)釋放大量的氧而面臨著嚴(yán)峻的氧化脅迫.此外,植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基,引起膜脂的過氧化、膜蛋白發(fā)生聚合等反應(yīng),從而破壞其生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,損傷植物細(xì)胞.提高植物體內(nèi)氧自由基代謝途徑中的酶活力,可以增強(qiáng)植物抵御氧化脅迫的能力,從而增強(qiáng)植物耐逆能力.植物體內(nèi)清除氧自由基的酶有超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX,EC1.11. 1.11)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等.其中,SOD、APX和GR可形成高效的抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán).APX是以抗壞血酸(AsA)為電子供體的一種過氧化物酶.APX是植物體內(nèi)尤其是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶[1].

APX催化的反應(yīng)為,2AsA+H2O2→2MDA(單脫氫抗壞血酸自由基)+2H2O.APX的催化循環(huán)屬于過氧化物酶的“乒乓機(jī)制”,其反應(yīng)如下(R表示卟啉或保守Trp殘基,MDA為單脫氫抗壞血酸,反應(yīng)速率為類囊體型APX的數(shù)值)[1]:

目前,APX基因序列已經(jīng)在菠菜、豌豆、擬南芥、西紅柿、水稻、馬鈴薯等植物中分離獲得[2-4].此外,豌豆APX蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)也已得到鑒定[5].研究表明,APX是一種包含原卟啉IX的血紅蛋白,它的分子量大約是30 kD,單體存在,但有幾種cAPX則以同二聚體形式存在[6].植物過氧化物酶超家族的特征是:含組氨酸(His-42)和精氨酸(Arg-38),末端的組氨酸與天冬酰氨(Asn-71)側(cè)鏈以氫鍵相連,而天冬酰氨(Asn-71)則以氫鍵與主鏈羰基谷氨酸(G lu-65)的羰基相連;在鄰近血紅素的位點(diǎn),組氨酸(His-163)與血紅素鐵結(jié)合,并與天冬氨酸(Asp-208)形成很強(qiáng)的氫鍵,這6個(gè)殘基在幾乎所有的APX中都是保守的[7].

2 植物APX基因家族成員組成與細(xì)胞內(nèi)分布

高等植物的APX存在著多種同工酶:一種是光合器官型,又稱葉綠體型同工酶,包括位于基質(zhì)中的APX(sAPX)和同類囊體膜結(jié)合的APX(tAPX);另一種是非光合器官型,在植物細(xì)胞的胞漿、線粒體和乙醛酸循環(huán)體中均有發(fā)現(xiàn).另外,根據(jù)APX各同工酶所在細(xì)胞中內(nèi)位置的不同,APX可分為胞質(zhì)APX同工酶APX(cAPX)、質(zhì)體基質(zhì)APX同工酶APX(sAPX和mitAPX)、過氧化物酶體APX(mbAPX)同工酶和葉綠體類囊體膜APX同工酶APX(tAPX),前兩者屬于可溶性同工酶,后兩者為膜結(jié)合同工酶.在細(xì)胞內(nèi),不同位置的APX同工酶具有不同的生化特性,即具有不同的分子量、底物特異性、最適pH值和對(duì)抗壞血酸的穩(wěn)定性[8].研究證明,葉綠體APX同工酶比胞質(zhì)APX同工酶、過氧化物酶體APX同工酶更加不穩(wěn)定,在無(wú)抗壞血酸存在的條件下會(huì)迅速失活[1].

此外,研究還發(fā)現(xiàn),在擬南芥中至少有6個(gè)基因編碼的APX蛋白,分別是:2個(gè)胞質(zhì)APX同工酶基因(At1g07890和At3g09640),2個(gè)過氧化物酶體APX同工酶基因(At4g35000和At4g35970),一個(gè)類囊體膜束APX同工酶基因(At1g77490),一個(gè)葉綠體/線粒體APX同工酶基因(At4g08390)[9].

2004年,Teixeira等[10]在水稻中分離出了8個(gè)APX同工酶基因,其中有2個(gè)胞質(zhì)APX同工酶(Os-APX1和OsAPX2),2個(gè)假定的過氧化物酶體同工酶(OsAPX3和OsAPX4),還有4個(gè)假定的葉綠體APX同工酶(OsAPX5-OsAPX8),其中OsAPX8被認(rèn)為是類囊體膜束APX同工酶.同時(shí),通過使用GFP作為標(biāo)簽對(duì)OsAPX3和OsAPX6 2個(gè)同工酶在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中的定位,證明了OsAPX3定位于過氧化物酶體內(nèi),而OsAPX6定位于線粒體內(nèi).

有研究表明:APX同工酶在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位由蛋白質(zhì)C、N端區(qū)域的導(dǎo)肽和跨膜結(jié)構(gòu)決定[11];過氧化物酶體APX同工酶的導(dǎo)肽組成C端的跨膜結(jié)構(gòu)域,該導(dǎo)肽富含纈氨酸(Valine)和丙氨酸(Ala),并且伴隨一個(gè)含有約5個(gè)氨基酸殘基的正電荷區(qū)域[12];過氧化物酶體APX同工酶通過粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接定位于過氧化物酶體,并且暴露于胞質(zhì)[13];與過氧化物酶體APX同工酶不同,所有的葉綠體APX同工酶在其N端具有羥基化的肽段,該部分在成熟蛋白質(zhì)中將被加工處理[14].另外,類囊體膜結(jié)合APX同工酶在其C端擁有一段跨膜的疏水結(jié)構(gòu)[15].

3 植物APX的組織與發(fā)育特異性表達(dá)調(diào)控

對(duì)植物來(lái)說,不同部位、不同組織的APX活性存在明顯差異.

謝小群等[16]對(duì)黃芩一年生植株種子、花瓣、頂芽、葉和根中APX活性的測(cè)定結(jié)果表明,不同部位、不同組織的APX活性差異顯著.其總活力順序依次為,頂芽＞葉＞根＞種子＞花瓣.試管苗生長(zhǎng)過程中,APX的總活力和比活力變化趨勢(shì)與試管苗生長(zhǎng)趨勢(shì)呈現(xiàn)較好的一致性,即在生長(zhǎng)初期,APX活性處于較低水平,7d后試管苗生長(zhǎng)旺盛,代謝活動(dòng)加強(qiáng),生物量迅速增加,APX活性也隨著代謝作用加強(qiáng)而急劇上升,此后,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗,生長(zhǎng)逐漸緩慢, APX活性下降.

Gadea等[17]對(duì)番茄果實(shí)的研究表明,在番茄成熟后期,因H2O2急劇積累,其CAT活性降到較低水平,而APX及GR受衰老影響不大,仍具有一定活性.所以,抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)可能在成熟后期及衰老過程中的H2O2代謝中發(fā)揮重要作用.

馮晴等[18]的研究表明,在小麥葉片衰老過程中,APX比CAT活力下降得晚,表明APX在小麥葉片衰老的中后期起著比CAT更重要的清除H2O2的作用.APX酶的增加,可能是衰老進(jìn)程對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié).CAT存在于過氧化體、乙醛酸循環(huán)體等微體中,而APX則存在于葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體和細(xì)胞質(zhì)中,葉綠體是產(chǎn)生 H2O2的主要場(chǎng)所,因此,APX清除H2O2要比CAT更直接.此外,在葉片衰老過程中,APX活力下降較晚,可能與AsA-GSH循環(huán)途徑中的單脫氫抗壞血酸自由基還原酶、雙脫氫抗壞血酸還原酶及谷胱甘肽還原酶的調(diào)節(jié)有關(guān).

4 植物APX的誘導(dǎo)表達(dá)特性

研究表明,在臭氧、SO2、Fe、Cu、百草枯、熱擊、強(qiáng)光等逆境條件下,細(xì)胞質(zhì)APX轉(zhuǎn)錄水平增加,而在冷、熱、紫外光、H2O2、鹽、百草枯等脅迫時(shí),過氧化物酶體APX的轉(zhuǎn)錄水平增加.而葉綠體APX正相反,在外界條件刺激下,其轉(zhuǎn)錄水平很少改變.但也有研究表明,在干旱時(shí),小麥的類囊體APX活性增加[19],菠菜葉片中APX活性明顯增加[20].另外,水楊酸(SA)能夠抑制APX活性,用特定電磁波處理作物干種子和發(fā)芽種子能顯著提高其APX活性.Spundova等[21]的研究表明,抗旱性不同的 2個(gè)小麥品種,其葉綠體基質(zhì)APX和類囊體結(jié)合的APX在幼苗期對(duì)抗旱響應(yīng)表現(xiàn)明顯不同,說明不同定位的APX可能在H2O2清除中發(fā)揮著不同作用.

目前,研究人員對(duì)于擬南芥與水稻的相關(guān)研究研究 比 較 系 統(tǒng)[22,23].比 如,擬 南 芥 AtAPx1 (At1g07890)基因在植物的不同組織都有表達(dá),并且其表達(dá)水平受各種脅迫條件的調(diào)節(jié),AtAPx2 (At3g09640)基因在光合維管束鞘細(xì)胞層的表達(dá)受光照和植物損傷的調(diào)控.AtAPx1同工酶是擬南芥消除活性氧的重要成員.此外,Davletova等[9]通過使用基因敲除方法的研究表明,在植物受到光照脅迫條件下,胞質(zhì)APX同工酶在保護(hù)葉綠體免受損傷方面發(fā)揮重要作用.

Teixeira等[24]揭示了水稻APX基因家族各基因在不同組織和各種環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)水平的相互協(xié)調(diào)性.Hong等[25]報(bào)道了水稻根中的APX8(Os-APX 8)受鹽濃度的影響較大,運(yùn)用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法,分別檢測(cè)了水稻APX1～APX8 mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在150 mmol/L和200 mmol/L NaCl條件下,水稻根部的OsAPX8表達(dá)量有所增加,但是其他家族成員的表達(dá)量卻不受影響,而在300 mmol/L NaCl的條件下,APX家族成員有著更復(fù)雜的變化, OsAPX8表達(dá)量有所增加,OsAPX7的表達(dá)量有所下降,但APX基因家族其他成員的表達(dá)量卻不受影響.同樣,外源脫落酸(ABA)的使用同樣會(huì)提高根中OsAPX8的表達(dá)水平.

D’Arcy-Lameta等[3]研究了在3種脅迫條件下(逐漸干旱、快速干燥、施用外源脫落酸ABA)碗豆葉子中的4種APX同工酶(細(xì)胞質(zhì)APX、過氧化物酶體APX、葉綠體基質(zhì)APX、類囊體APX)的基因表達(dá)情況,研究表明,在干旱脅迫下,耐旱型植株的APX酶活基本不變,而干旱敏感型植株的APX酶活較對(duì)照增加了78%,這與有些文獻(xiàn)中的報(bào)道相矛盾,作者分析指出,酶的活性應(yīng)該視加于植物上的脅迫以及植物本身對(duì)脅迫的抗性和敏感性而定.干旱引起的膜損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞隔區(qū)的破壞,因此不可能在水分脅迫下準(zhǔn)確地測(cè)定不同的細(xì)胞隔區(qū)的APX活性.為了更好地了解每種APX同工酶的作用,作者還克隆了不同同工酶的基因,分別研究它們?cè)诓煌{迫下的表達(dá)水平.研究表明,在快速干燥和施用外源ABA時(shí),干旱敏感型植株的細(xì)胞質(zhì)APX和過氧化物酶體APX的基因轉(zhuǎn)錄增加,而耐旱型植株相應(yīng)同工酶的轉(zhuǎn)錄水平保持穩(wěn)態(tài).

Park等[26]在成功克隆甘薯的swAPX1基因后,又研究了該基因在各種非生物和生物脅迫下的表達(dá)情況.swAPX1基因只在甘薯的成熟葉片和培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞中表達(dá),在莖、儲(chǔ)藏根和非儲(chǔ)藏根中卻沒有表達(dá),而且在懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中,swAPX1的表達(dá)量不斷的增加.通過 RT-PCR方法,Park等發(fā)現(xiàn)swAPX1基因在葉片中的表達(dá)受各種非生物脅迫條件的調(diào)控.損傷、50 mmol/L甲基紫精、440 mmol/L過氧化氫或100μmol/L脫落酸條件下,swAPX1基因的表達(dá)量均明顯升高.另外,在細(xì)菌病原體感染的條件,swAPX1基因的表達(dá)量也會(huì)增加.同時(shí),該結(jié)論也證明了swAPX1基因在清除甘薯葉片中的過氧化氫方面發(fā)揮了重要作用,從而有利于植株克服非生物和生物脅迫造成的氧化損傷.

Yabuta等[27]的研究表明,在轉(zhuǎn)基因煙草中,葉綠體APX在清除活性氧體系中發(fā)揮著很重要的作用,它保證了葉片的葉組織在水—水循環(huán)和光合作用中維持能量.Davletova等[9]的研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中,如果缺乏細(xì)胞質(zhì)APX時(shí),會(huì)導(dǎo)致葉綠體和過氧化物酶體的的H2O2清除系統(tǒng)瓦解,從而不能清除光合作用和光呼吸中產(chǎn)生的H2O2,因而導(dǎo)致了H2O2含量升高,蛋白發(fā)生氧化.Hossain等[28]的研究發(fā)現(xiàn), APX的活性降低是引起劍蘭的花衰老的決定條件,所以,細(xì)胞質(zhì)APX作為活性氧清除體系中的中心物質(zhì)也是極其重要的,作用機(jī)制可能涉及到一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).

5 植物APX在基因工程中的應(yīng)用

現(xiàn)已證實(shí),增強(qiáng)植物耐逆性的途徑之一是提高植物體內(nèi)抗氧化酶類活性及增強(qiáng)抗氧化代謝的水平.轉(zhuǎn)基因植物中APX的過量表達(dá),已經(jīng)被證明可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性.目前,研究人員已從棉花、擬南芥等植物中克隆了APX基因,并進(jìn)行了部分轉(zhuǎn)基因植物的研究.例如,擬南芥中tAPX的過量表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)除草劑(Paraquat)誘導(dǎo)的光合氧化脅迫和氧化氮誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性[19].此外,Wang等[29]將一個(gè)細(xì)胞質(zhì)APX(cAPX)基因轉(zhuǎn)入番茄中過量表達(dá),結(jié)果顯著提高了轉(zhuǎn)基因番茄的抗寒和抗鹽能力.Sarowar等[30]將一個(gè)辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力,同時(shí),該實(shí)驗(yàn)室研究人員也將一個(gè)楊樹過氧化物酶體APX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱耐鹽能力[31].Sun等[32]將StAPX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的對(duì)鹽與滲透脅迫的抗性.

此外,APX轉(zhuǎn)基因的反義表達(dá)可以研究是否提高植物體的維生素C含量,也可以研究呼吸作用多條線路的選擇性.Tarantino等[33]的研究表明,在擬南芥中降低類囊體APX的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)百草枯和一氧化氮抗性的顯著下降.Rizhsky等[34]的研究表明, APX及CAT的雙反義植物比APX或CAT單反義植物對(duì)氧化脅迫更不敏感.

6 結(jié) 語(yǔ)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)與基因工程的迅猛發(fā)展,研究人員通過分離等技術(shù)手段得到了各種植物的抗逆基因,如APX、SOD、POD等.但是,目前的研究已不僅僅局限于對(duì)各種抗逆基因的分子克隆和蛋白的活性分析,學(xué)者們更關(guān)注的是其在各種脅迫條件下功能的調(diào)節(jié)以及每個(gè)成員之間的相互關(guān)系.

APX同工酶的表達(dá)狀況受處于各種脅迫條件下的各個(gè)細(xì)胞區(qū)室的分別調(diào)控.因此,研究APX在植物細(xì)胞中的定位,比較逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)APX同工酶對(duì)于氧化脅迫的敏感性以及它們活性的大小將成為今后研究的一個(gè)方向.同時(shí),APX基因家族每個(gè)成員在植物發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)調(diào)節(jié)和各個(gè)成員之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系也是研究的一個(gè)熱點(diǎn).另外,在APX同工酶表達(dá)過程中涉及的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),以及H2O2作為第二信使方面的研究也是一個(gè)重點(diǎn).

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