宋愛環(huán), 李成林, 朱 虎, 胡 煒, 李翹楚, 趙 斌, 張 豫

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國(guó)石油大學(xué)(華東) 生物工程與技術(shù)中心, 山東 青島266555)

刺參養(yǎng)殖池塘中一株益生芽孢桿菌的分離及鑒定

宋愛環(huán)1, 李成林1, 朱 虎2, 胡 煒1, 李翹楚1, 趙 斌1, 張 豫1

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國(guó)石油大學(xué)(華東) 生物工程與技術(shù)中心, 山東 青島266555)

針對(duì)目前刺參池塘養(yǎng)殖中微生態(tài)制劑施用混亂、標(biāo)準(zhǔn)不一以及效果不穩(wěn)定性等現(xiàn)狀, 本研究從刺參養(yǎng)殖池塘底泥中分離土著芽孢桿菌菌株, 并通過菌落形態(tài)特征、16s rDNA測(cè)序分析和生理生化試驗(yàn)對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定, 確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis), 命名為XA-01, 該菌可為微生態(tài)制劑的制備提供優(yōu)良的菌種來源, 并將在海水養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的修復(fù)中得到利用。

刺參(Apostichopus japonicusSelenka); 養(yǎng)殖池塘; 芽孢桿菌(Bacillus); 分離鑒定

廣闊的市場(chǎng)需求和極大的利潤(rùn)空間, 使刺參養(yǎng)殖成為繼海帶、對(duì)蝦、扇貝、海水魚養(yǎng)殖浪潮之后興起的又一新的支柱產(chǎn)業(yè)品種, 刺參(Apostichopus japonicusSelenka)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已成為北方沿海漁民增收致富和捕撈漁民轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)的新途徑。山東刺參養(yǎng)殖發(fā)展速度之快, 規(guī)模之大更是前所未有, 據(jù)初步統(tǒng)計(jì), 到2009年山東沿海刺參育苗場(chǎng)規(guī)模在1 000 m3以上水體的場(chǎng)家超過 1 000家, 育苗水體超過 8×105m3, 苗種生產(chǎn)能力達(dá)到100億頭, 養(yǎng)殖面積超過4.1×104hm2, 年產(chǎn)鮮參達(dá)到6.2萬t, 產(chǎn)值達(dá)到111.8億元, 約占全省海水養(yǎng)殖總產(chǎn)值的 1/3, 是山東省最大的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[1]。然而, 受巨大利潤(rùn)空間的驅(qū)使,刺參苗種繁育和養(yǎng)殖規(guī)模無序開發(fā),尤其是刺參養(yǎng)殖池塘老化嚴(yán)重, 缺乏有效的池底改良與清池消毒處理, 加之多數(shù)刺參苗種生產(chǎn)場(chǎng)家設(shè)備簡(jiǎn)易、工藝粗糙,育苗用水量大, 育苗廢水不經(jīng)處理直接排放入海,嚴(yán)重污染海洋生態(tài)環(huán)境, 導(dǎo)致以“爛嘴”、“吐臟”、“搖頭”、“化皮”等為主要特征的“刺參腐皮綜合病癥”頻繁發(fā)生, 不同程度地波及并危害到各主要刺參養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū), 每年損失達(dá)十余億元。

2006年, 歐盟全面禁止飼料中抗生素的使用,美國(guó)和日本等國(guó)家也對(duì)抗生素的使用作了嚴(yán)格的規(guī)定[2]。微生態(tài)制劑以其無毒、無殘留、無抗藥性、生態(tài)健康等諸多優(yōu)點(diǎn)成為近幾年來海水養(yǎng)殖中不可替代的改良劑[3]。而芽孢桿菌是第一種應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌[4], Laurent等[5]將芽孢桿菌(Bacillus)應(yīng)用于日本鰻養(yǎng)殖中, 減少了由病原菌Edwardsiellasp.引起的鰻魚大量死亡?，F(xiàn)代化的高效、生態(tài)、可持續(xù)發(fā)展的海水養(yǎng)殖新理念使芽孢桿菌等益生菌類應(yīng)用得到了廣泛的關(guān)注和研究。王亞南等[6]從近海養(yǎng)蝦場(chǎng)不同深度的底泥中分離到芽孢桿菌; 安健等[7]從對(duì)蝦池塘中篩選到好氧反硝化細(xì)菌——凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),并研究了其亞硝酸鹽氮降解性能。張國(guó)慶等[8]從雞舍附近的土壤中成功分離到一株益生芽孢桿菌—巨大芽孢桿菌。目前尚未發(fā)現(xiàn)從刺參養(yǎng)殖池塘中分離微生態(tài)菌株的相關(guān)報(bào)道, 因此,本試驗(yàn)從刺參養(yǎng)殖池塘中分離篩選益生芽孢桿菌,以期為刺參池塘養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控、底質(zhì)改良和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)提供可靠的基礎(chǔ)材料和有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品： 采集于山東東方海洋科技股份有限公司海陽(yáng)分公司刺參養(yǎng)殖池塘中的泥樣。

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 富集培養(yǎng)基

可溶性淀粉 10 g, 酵母提取物 25 g, 蛋白胨 2 g, NH4Cl 5 g, KH2PO41 g, Na2HPO4·12H2O 5 g,MnSO4·H2O 0.1 g, H2O 1 L, pH 7.2～7.4。

1.1.1.2 分離培養(yǎng)基

蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g, NaCl 10 g, 瓊脂20 g, H2O 1 L, pH7.2～7.4。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

冷凍高速離心機(jī)： T1/RT1, Thermo Scientific; 潔凈工作臺(tái)： SW-CJ-2F, 蘇州安泰; 冷凍恒溫振蕩器：DHZ-DA, 培英; 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)： 1600,Tanon; PCR 擴(kuò)增儀： Mastercycle, eppendorf; 電泳儀：EPS 600, Tanon。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與純化培養(yǎng)

將采集的泥樣低溫保存, 及時(shí)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室處理。根據(jù)篩選的不同菌種的生理特點(diǎn)做不同的處理。將5～7 g底泥分別加入到100 mL無菌生理鹽水的三角瓶中, 30℃下150～180 r /min振蕩25 min。無菌條件下取菌懸液1 mL置于盛有9 mL無菌水的試管, 混合均勻制成稀釋度為 10-1的菌懸液, 同樣方法再做 5個(gè)稀釋度, 即 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。將稀釋度為 10-5、10-6的菌懸液各取 100 μL涂抹在不同菌種所需要的培養(yǎng)基上, 30℃培養(yǎng)3～7 d。挑選生長(zhǎng)良好、菌落較大的菌落劃線分離, 重復(fù)2～3次后挑選優(yōu)勢(shì)菌落接種于斜面保藏培養(yǎng)基中, 冰箱4℃保藏。

1.2.2 菌落形態(tài)特征

將分離得到的芽孢桿菌接種于培養(yǎng)基平板上,30℃活化培養(yǎng)1 d, 觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.3 細(xì)菌生理生化鑒定

主要進(jìn)行菌株的 V-P測(cè)定、甲基紅試驗(yàn)、明膠水解、淀粉水解、NaCl耐鹽實(shí)驗(yàn)等。菌株的生理生化特性實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法參考《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)及試驗(yàn)教程》[9]。

1.2.4 16S rDNA鑒定

1.2.4.1 細(xì)菌總DNA提取

用Genomic DNA purification kit (Biodev, Beijing)制備細(xì)菌基因組DNA。

1.2.4.2 16SrDNA的擴(kuò)增

所用引物由上海生工生物有限公司合成, 序列為：

正 向 引 物 ： fD1： 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

反向引物： rD1： 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

PCR 反應(yīng)體系(48 μL)： 1 μL 模板 DNA, 各1 μL fD1 和 rD1, 4 μL dNTP, 5 μL 10×Taq緩沖液,0.25 μLTaq聚合酶, 37.75 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30 s; 55℃退火1 min; 72℃延伸90 s, 循環(huán)30次, 72℃延伸10 min。

1.2.4.3 PCR產(chǎn)物的回收純化

取 10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于 1.0%瓊脂糖凝膠上電泳,電壓為5 V/cm, 電泳時(shí)間30 min, 電泳完畢, 于紫外燈下觀察結(jié)果。用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收, 連接于上海生工公司 pUCm-T Vector載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a。在氨芐青霉素(100 μg/mL)LB平板(含40 ng/mL的X-gal和0.1 mmol/L的IPTG)上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.2.4.4 DNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)公司完成。將16S rDNA所測(cè)序列通過BLAST檢索程序與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行分析, 利用Clustal X1.8進(jìn)行序列比對(duì), 用MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)與菌落特征

XA-01菌株在培養(yǎng)基平板上 30℃培養(yǎng) 48 h后,菌落乳白色, 呈突起的圓形或近圓形。菌株 XA-01的菌落見圖1。

圖1 芽孢桿菌的分離純化Fig. 1 Isolation and purification of Bacillus thuringiensis.

2.2 細(xì)菌生理生化特征

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[11], 該菌株呈現(xiàn)芽孢桿菌屬特征,所屬菌種鑒定為蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis), 命名為 XA-01。常規(guī)生理生化特性見表1。

2.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

XA-01菌株16S rDNA測(cè)序全長(zhǎng)1 421 bp, 申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)為HQ710547。同時(shí), 該菌株的16S rDNA序列經(jīng) BLAST檢索程序分析, 通過 Clustal X1.8進(jìn)行多重對(duì)比, 并用 MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)合上述生理生化特征分析, 確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)。結(jié)果見圖2和圖3。

表1 XA-01菌株的生理生化特征Tab. 1 Morphology and physiology characteristics of strain XA-01

圖2 16SrDNA擴(kuò)增的PCR圖Fig. 2 PCR-amplification of 16S rDNA

圖3 基于16S rDNA序列的NJ系統(tǒng)樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

3 討論

16S rDNA已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于評(píng)價(jià)生物的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 準(zhǔn)確 、高效、靈敏、方便, 逐漸成為菌種鑒定的有效手段。潘康成等[12]從動(dòng)物腸道分離得到三株益生芽孢桿菌, 并運(yùn)用16S rDNA進(jìn)行了種的鑒定。張國(guó)慶等[8]從雞舍的土壤中分離到一株益生芽孢桿菌并進(jìn)行了 16S rDNA鑒定。王彥波[13]從南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中分離得到芽孢桿菌菌株并從生理生化方面進(jìn)行了鑒定。蘇云金芽孢桿菌是一類能在代謝過程中產(chǎn)生芽孢和伴孢晶體的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌, 其制劑是目前世界上產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑[14]。蘇云金芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究廣泛而深入, 有關(guān)蘇云金芽孢桿菌的殺菌活性的研究報(bào)道較多[15-17]。目前, 微生態(tài)制劑的市場(chǎng)需求非常大, 可是其種類和功能卻參差不齊, 在一定程度上影響了其市場(chǎng)前景。以北方海水養(yǎng)殖環(huán)境作為來源的土著微生態(tài)制劑的開發(fā)和應(yīng)用尚未發(fā)展起來, 因此, 分離培養(yǎng)并研制土著微生物制劑對(duì)于有效調(diào)控北方池塘海水養(yǎng)殖環(huán)境意義重大。蘇云金芽孢桿菌在海水養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究還剛剛起步, 本試驗(yàn)首次從刺參養(yǎng)殖池塘的底泥中分離一株益生芽孢桿菌, 并從生理生化、分子生物學(xué)方面對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究與分析, 確定為蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis), 并命名為 XA-01, 為以后刺參池塘養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境調(diào)控技術(shù)研究提供了優(yōu)良的土著菌種,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Isolation and identification of a strain of probioticBacillusfrom maricultural pond ofApostichopus japonicusSelenka

SONG Ai-huan1，LI Cheng-lin1，ZHU Hu2，HU Wei1，LI Qiao-chu1，ZHAO Bin1，ZHANG Yu1
(1. Mari-culture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Bioengineering and Technology Center,China University of Petroleum (East China), Qingdao 266555, China)

Dec., 23, 2010

Apostichopus japonicusSelenka; maricultural pond;Bacillussp; isolation and identification

A probiotic strain of native bacillus has been isolated from maricultural pond of sea cucumber in this study. By observing its colony morphology, sequence analysis of its 16s rDNA, and physiological and biochemical experiments, the strain was identified to beBacillus thuringiensis,and was named XA-01. It can be used in developing microbial ecological agents for environmental remediation of mariculture.

Q93

A

1000-3096(2011)05-0038-04

2010-12-23;

2011-01-15

國(guó)家“863”計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006AA10A411); 山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008GG10005004); 山東省農(nóng)業(yè)良種工程重點(diǎn)項(xiàng)目(2005-2012年); 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題(2009-2012年);山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目(2009-2012年); 山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2010-2013年)

宋愛環(huán)(1978-), 女, 山東即墨人, 助理研究員, 主要從事海洋微生物學(xué)及水產(chǎn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究, E-mail： zjusah@163.com; 李成林,通信作者, 電話： 0532-82684701, E-mail： lcl_xh@hotmail.com

梁德海)