彭強(qiáng)，班謙，賈斌，李洪濤

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

Zfy基因是睪丸決定因子（testis－determining facter，TDF）的候選基因［1］，其編碼的鋅指蛋白與核酸結(jié)合有關(guān)，在早期胚胎性別決定中起著重要作用［2－3］。Zfy基因位于 Y 染色體短臂（Yp11．3）上，有11個(gè)外顯子和1個(gè)隨機(jī)重復(fù)區(qū)域的13個(gè)“鋅－指”結(jié)構(gòu)［4］，有約801個(gè)氨基酸，30個(gè)氨基酸殘基，由2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸配位1個(gè)鋅離子構(gòu)成［5］。其具有2個(gè)核定位信號(hào)區(qū)和DNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠特異性的與靶基因結(jié)合，引導(dǎo)靶基因穿過(guò)核膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，其編碼蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子，在精子形成過(guò)程中具有一定功能［6］，與精子的發(fā)生有關(guān)［7］。Zfy基因是繼SRY基因之后的又一睪丸決定因子。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 （post－transcriptional gene Silencing，PTGS）現(xiàn)象，能夠高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，引起轉(zhuǎn)錄后同源mRNA的降解［8］。該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在生物學(xué)上的應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義，其快速、簡(jiǎn)潔、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，使其一出現(xiàn)就受到科研工作者的青睞。目前關(guān)于RNAi的作用原理已經(jīng)初步認(rèn)清［9－10］，且有機(jī)體可以利用RNAi來(lái)抵御病毒及其它外來(lái)核酸的侵入［11］。RNAi可成為基因功能分析和基因治療的一種有效工具，用來(lái)抑制特定基因的表達(dá)。

RNAi技術(shù)的出現(xiàn)和迅速發(fā)展為我們探究Zfy基因的功能提供了新手段。本研究根據(jù)Zfy基因的特點(diǎn)，構(gòu)建了2個(gè)以小鼠Zfy基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA干 涉 載 體 pSilencer5．1／Zfy225 及 pSilencer5．1／Zfy2122，

利用RNAi方法干擾生精過(guò)程中Zfy基因的表達(dá)，達(dá)到限制甚至損害Y精子的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)育，再進(jìn)行受精，進(jìn)而達(dá)到人為影響后代性別的目的，同時(shí)也為研究性別控制提供了一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

選取8周齡健康的雄性昆明小白鼠32只，購(gòu)自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)所用的小鼠均飼養(yǎng)在定期滅菌的控溫鼠房，自由采食和飲水。經(jīng)檢測(cè)所有試驗(yàn)小鼠的繁殖性能良好。

1．2 方法

1．2．1 Zfy基因RNAi重組載體構(gòu)建與體外驗(yàn)證

設(shè)計(jì)Zfy基因的RNAi靶序列，通過(guò)BLAST分析以及siRNA相關(guān)設(shè)計(jì)原則［12］，篩選出了2條siRNA。分別在5′和3′端引入限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)，合成發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）寡核苷酸鏈及其互補(bǔ)鏈（表1）。

分別將Zfy225與Zfy2122的上下游合鏈，再連入經(jīng)BamHI和HindIII（TaKaRa公司）雙酶切的pSilencer5．1－H1Retro載體（Ambion上海吉泰生物工程有限公司），構(gòu)建成siRNA表達(dá)載體pSilencer5．1／Zfy 225（簡(jiǎn)稱(chēng)p225），pSilencer5．1／Zfy2122（簡(jiǎn)稱(chēng)p2122），并轉(zhuǎn)化到E．coli Top 10感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化有限公司）中，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司）按說(shuō)明書(shū)操作提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切鑒定重組質(zhì)粒后，送生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

經(jīng)體外細(xì)胞水平上的驗(yàn)證表明，siRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，能特異性抑制小鼠生精細(xì)胞中Zfy基因的表達(dá)。

表1 shRNA寡核苷酸序列Tab．1The oligo sequence for shRNA template

1．2．2 Zfy基因體內(nèi)RNAi試驗(yàn)

1．2．2．1 Zfy基因RNAi片段的導(dǎo)入

通過(guò)前期試驗(yàn)摸索體內(nèi)RNA干擾的最佳條件，確定采用睪丸局部注射質(zhì)粒40mg／次導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。將32只雄鼠隨機(jī)分成4組（每組8只），試驗(yàn)I組、II組分別注射重組質(zhì)粒p225與p2122，陰性對(duì)照組注射空載體pSilencer5．1－H1Retro作為對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組注射同等體積的生理鹽水。間隔10d注射1次，連續(xù)注射4次，最后1次注射17d后，將各組的雄鼠處死，迅速取出睪丸組織放入液氮速凍保存。

1．2．2．2 qRT－PCR測(cè)定睪丸Zfy基因 mRNA 豐度檢測(cè)

采用 Trizol（美國(guó)Invitrogen）法提取睪丸RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體積為20μL，體系為：2μg總 RNA、0．5mmol／L dNTP 和 5 μmol隨機(jī)引物，在75℃下變性5min，隨后立即置冰上冷卻，再加入20URNA酶抑制劑（RNase inhibitor）、10U 反轉(zhuǎn)錄酶（AMV RTase）、4．0μL 5×RT Buffer，42℃反應(yīng)60min，最后在95℃下變性5 min。利用熒光實(shí)時(shí)定量（stratagene，MX3000P）PCR方法檢測(cè)Zfy基因的mRNA表達(dá)水平，所用引物信息見(jiàn)表2。

PCR反應(yīng)體系的總體積為25．0μL，其中含12．5μL SYBR＠ Premix Ex TaqTM（2×）（大連寶生物），上下游引物（10．0μmol／L ）各0．5μL，2．0 μL cDNA模板，加ddH2O至終體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性30s，95℃變性5s，退火15s（退火溫度見(jiàn)表2），72℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)對(duì)所有樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)測(cè)定，并在每次試驗(yàn)時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。將克隆有目的片斷的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 目的基因引物序列及PCR條件Tab．2Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用相對(duì)定量解析的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以Gapdh為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)計(jì)分析定量檢測(cè)結(jié)果。所得數(shù)據(jù)利用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉχ±SE），單因子方差分析（one－way ANOVA，LSD）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，并進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

利用qRT－PCR檢測(cè)經(jīng)RNAi后試驗(yàn)組與注射生理鹽水與空載體的對(duì)照組Zfy mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：注射重組載體p2122，Zfy基因mRNA表達(dá)水平極顯著低于對(duì)照組（P＜0．01）；注射重組載體p225，Zfy基因mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0．05）。重組載體p2122組與p225組之間差異顯著（P＜0．05）（圖1）。

圖1 Zfy基因mRNA表達(dá)情況Fig．1The mRNA expression level of Zfy gene

3 討論

Vergnaud等［13］發(fā)現(xiàn)并克隆了Zfy基因，Page等［14］明確指出Zfy基因與性別分化、精子發(fā)生有關(guān)，在X染色體上存在其同源序列Zfx。Zfy基因是Y染色體短臂上特異性單拷貝序列，一直以來(lái)人們針對(duì)Zfy／Zfy基因的特異性進(jìn)行性別鑒定［15－16］。王晗等［17］根據(jù)小鼠的Zfy／Zfy 基因設(shè)計(jì)PCR引物，將2－細(xì)胞、4－細(xì)胞、8－細(xì)胞和16細(xì)胞胚胎采用微量細(xì)胞樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增，鑒定胚胎的性別，經(jīng)核型分析表明鑒定胚胎的準(zhǔn)確率達(dá)到95．2%（20／21）。于萍等［18］用巢式 PCR 擴(kuò)增母體血漿中胎兒游離DNA的Zfy基因，進(jìn)行產(chǎn)前診斷，準(zhǔn)確率為84．8%（39／46）。徐艷春等［19］利用哺乳動(dòng)物的毛發(fā)作為材料提取DNA，擴(kuò)增Zfy／Zfy基因，隨機(jī)選取8種動(dòng)物進(jìn)行性別鑒定，得到的結(jié)果與表型完全一致。另外根據(jù)Zfy基因具有高度保守性的特點(diǎn)，毛德才等［20］、金梅等［21］擴(kuò)增第11外顯子并測(cè)序，分析物種之間的進(jìn)化關(guān)系。Reynolds等［7］還指出Zfy基因與精子發(fā)生相關(guān)。本文利用RNAi技術(shù)結(jié)合RT－PCR的方法探討小鼠生精過(guò)程中Zfy基因的功能，結(jié)果可為受精前進(jìn)行性別控制奠定基礎(chǔ)。

目前普遍認(rèn)為性別決定過(guò)程可能是以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)，在胚胎發(fā)育的特定階段，由一系列上游或下游基因參與和協(xié)調(diào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終完成雄性性別分化的過(guò)程［22－23］。趙 金 紅 等［24］利 用 RNAi的 方法抑制雄性胚胎SRY基因的表達(dá)，抑制率達(dá)到85%。由于SRY基因只能引導(dǎo)雄性性別的分化，即使干擾了SRY基因，胚胎的性別不一定會(huì)向著雌性分化，可能會(huì)產(chǎn)生性別畸形。因此本文采用RNAi技術(shù)干擾與精子發(fā)生相關(guān)的特異性基因Zfy，在精子形成過(guò)程中限制或損壞Y精子的功能發(fā)育，使更多的X精子獲得受精的機(jī)會(huì)，從而產(chǎn)生雌性后代。

Zinmemann等［25］將載脂蛋白基因的siRNAs包裹入微脂膠囊中，通過(guò)單注射導(dǎo)入獼猴體內(nèi)，RNAi效果持續(xù)了11d。據(jù)報(bào)道小鼠的生精上皮周期是8．6d［26］，他們將再發(fā)育成具有受精能力的精子，需要約8d，即從精原干細(xì)胞開(kāi)始分化到精子完全成熟需要16．6d。本研究考慮到siRNAs在體內(nèi)穩(wěn)定存在的時(shí)間以及精子成熟時(shí)間，采取間隔10d注射1次，共注射4次，最后1次注射17d后，即從第1次注射到最后采集睪丸組織，共計(jì)47d。從而盡可能保證雄鼠睪丸附睪中的絕大部分精液在Zfy基因干擾過(guò)程中產(chǎn)生。本研究的后部分試驗(yàn)正在進(jìn)行中，將已經(jīng)干擾Zfy基因的雄鼠與雌鼠交配，觀察其后代性別比例，可為研究Zfy基因在小鼠生精過(guò)程中的作用及其對(duì)動(dòng)物性別的影響的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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