王剛剛，劉琳，尤偉艷，梁偉華，蔣金芳，李洪安，胡建明，常彬，趙瑾，李鋒

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

人乳頭瘤病毒（Human Papillomaviruses，HPV）為直徑52～55nm的二十面體病毒，屬于乳頭瘤多空病毒科乳頭瘤病毒屬，人類(lèi)是其唯一的宿主，皮膚及粘膜組織可被感染。根據(jù)未知HPV型L1序列與已知HPV型L1序列同源性，可對(duì)未知HPV進(jìn)行定義，如果L1序列同源性小于90%，則定義為新的型（Type）；如果L1序列同源性在90%～98%，則定義為已知HPV型的亞型（Subtype）；如果L1序列同源性大于98%，則定義為已知HPV型的變異體（Variant）。目前，Yamada所描述的 HPV16變異體可分為如下幾支：歐洲變異體（Eropean variant，E）、亞洲變異體（Asia variant，As）、亞－美洲變異體（Asia－American variant，AA）、非洲1變異體（Africa－1variant，Af－1）、非洲 2 變 異體（Africa－2variant，Af－2）、北美1變異體（North American 1，NA－1）［1］。HPV變異體的分布有明顯的地域性差異與種族差異。

宮頸癌的主要病因有已經(jīng)公認(rèn)的高危型人乳頭瘤狀病毒（High risk－h(huán)uman papilloma virus，HRHPV）感染，研究發(fā)現(xiàn)某些HPV16變異體及某些位點(diǎn)的變異能增加患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)軟件客觀地建立維吾爾族宮頸癌中HPV16變異體的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，初步研究維吾爾族宮頸癌中HPV16變異體的分布情況。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病例收集 收集宮頸癌樣本選取新疆喀什地區(qū)陸軍第12醫(yī)院和喀什地區(qū)人民醫(yī)院病理科2001～2009年間維吾爾族宮頸鱗癌經(jīng)手術(shù)切除、福爾馬林固定、石蠟包埋組織，蠟塊保留時(shí)間從3～10年不等。HPV16經(jīng)深圳亞能膜芯片技術(shù)檢測(cè)為HPV16陽(yáng)性病例40例宮頸癌為研究對(duì)象?；颊吣挲g25～65歲，中位45．00歲，平均（45．11±10．482）歲。HPV16質(zhì)粒由德國(guó)海德堡大學(xué)HAUSEN教授饋贈(zèng)。

1．1．2 引物

引物序列等詳見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Tab．1Sequences of PCR primers

PCR引物包括β－globin、HPV16E6引物，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．1．3 DNA及質(zhì)粒抽提試劑盒 Qiagen石蠟組織提取試劑盒（凱杰生物技術(shù)上海有限公司）、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）．

1．2 方法

1．2．1 HPV16質(zhì)粒的抽提及檢測(cè) （1）感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染：挑取DH5α大腸桿菌原種，在LB瓊脂板上劃線(xiàn)，培養(yǎng)過(guò)夜，挑菌到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌，移至離心管冰浴，離心回收細(xì)菌沉淀，加入冰預(yù)冷的CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀，加入4mL 0．1 moL／L CaCl2重懸細(xì)菌沉淀，這時(shí)的細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。加甘油至終濃度為15%～20%，混勻，分裝成200μL／份，－70℃凍存。取感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物，冰浴，水浴熱激，立即冰??；加液體LB復(fù)活；取200μL鋪于含100μg／mL Amp、X－gal和IPTG LB平板；37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h后觀察。（2）搖菌及封存甘油菌制備和凍存：無(wú)菌條件下取小量培養(yǎng)的重組質(zhì)粒的菌液1mL加入1．5 mLEp管中，再加入40%甘油0．5mL，混勻后用塑料薄膜封口，－80℃保存。（3）質(zhì)粒抽提：從恒溫?fù)u床中取出培養(yǎng)的成云霧狀渾濁的細(xì)菌，離心，棄上清，收集菌體，用溶液P1重懸菌體沉淀，漩渦振蕩，加入溶液P2混合，使菌體充分裂解，直至溶液變得清亮，加入溶液P3，立即溫和翻轉(zhuǎn)，室溫放置5min，離心，取上清；將上清液加入吸附柱AC中，離心，棄濾液。加入去蛋白PE，離心，棄濾液。加入漂洗液WB，離心，棄濾液?？罩?，離心，室溫晾干；取出吸附柱AC，放入離心管中，加入雙蒸水，室溫放置1 min，離心洗脫DNA，即為提取的質(zhì)粒DNA溶液，－20℃保存，取1μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其純度。

1．2．2 基因組DNA的制備及檢測(cè) 組織切片（5 μm）10張，裝入2．0mL的滅菌Ep管中；加入二甲苯脫蠟，離心，棄上清，加入無(wú)水乙醇，離心棄上清，晾干，加細(xì)胞裂解液輕混，加蛋白酶K輕混，封口，水浴過(guò)夜；95℃水浴5min滅活蛋白酶K，離心，迅速加入Buffer AL，震蕩混勻，加入無(wú)水乙醇，震蕩混勻；離心后轉(zhuǎn)移全部裂解液至QIAamp層析柱，離心，將柱子放入干凈收集管，打開(kāi)柱子，加入Buffer AW1（用前輕混），離心，將柱子放入干凈收集管，打開(kāi)柱子，加入Buffer AW2，離心；將柱子放入干凈收集管，全速離心，使膜完全干燥；將柱子放入干凈的Ep管中（試劑盒未提供），打開(kāi)柱子，加入Buffer ATE，室溫下蓋蓋孵育，全速離心，所得產(chǎn)物－20℃凍存?zhèn)溆?。NanoDrop分光光度計(jì)定量檢測(cè)DNA濃度及純度。

1．2．3 PCR擴(kuò)增目的片段 25μL的反應(yīng)體系檢測(cè)β－globin、HPV16E6F1R1、HPV16E6F2P2，見(jiàn)表2。

反應(yīng)條件：94℃4min（1×）；94℃45s，退火45s，72℃45s（35×）；72℃10min（1×）。退火溫度由左到右分別為56℃，54℃，56℃，52℃。擴(kuò)增完后在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物質(zhì)量。質(zhì)量合格PCR產(chǎn)物送交Invitrogen公司純化后，雙向測(cè)序。

表2 PCR反應(yīng)體系Tab．2Systems of PCR reactions

1．2．4 HPV16變異體進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 參照序列Gen－Bank編碼如下：SihaHPV16E6（AF003019．1）；CaskiHPV16E6（AF003018．1）；HPV16EP （K02718．1）；HPV16E131G（AF536179．1）；HPV16As（AJ388066．1）；HPV16AA（AF402678．1）；HPV16Af1（AF536180．1）；HPV16Af2（AF486324．1）HPV16NA－1（AF486325．1）；Xinjiang HPV16E6（AF327851．1）。

用Chromas軟件查看測(cè)序波峰圖，用DNAStar軟件中Seqman程序分析、拼接、與標(biāo)準(zhǔn)序列比較發(fā)現(xiàn)其中變異位點(diǎn)，后用其中EditSeq程序?qū)⑵唇雍玫暮塑账嵝蛄信c標(biāo)準(zhǔn)序列翻譯為氨基酸序列并加以比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)氨基酸變化，應(yīng)用Clustal 1．80將核苷酸序列比較并將文件的格式由“＊．seq”轉(zhuǎn)變“＊．a(chǎn)ln”，后者用 MEGA4．1 軟件分析并構(gòu)建HPV16系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

樣本HPV16變異與臨床病例資料分析，采用卡方檢驗(yàn)分析兩兩之間的相關(guān)性。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，計(jì)數(shù)資料組間的比較使用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0．05視差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)用SPSS17．0軟件包處理。

2 結(jié)果

2．1 基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

所選新疆維吾爾族宮頸癌40例，經(jīng)β－globin PCR擴(kuò)增檢測(cè)成功37例。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做2%瓊脂糖凝膠電泳，210bp處出現(xiàn)目的片段（圖1），說(shuō)明樣本DNA均可用于HPV16變異檢測(cè)。

維吾爾族宮頸癌中β－globin PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性37例樣本，全用于HPV16E6擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，214bp（35／37例）、343bp（31／37例）處出現(xiàn)目的片段（圖2），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)樣本可用于后續(xù)的測(cè)序。

圖1 宮頸癌β－globin擴(kuò)增電泳Fig．1Electrophotogram ofβ－globin amplification in cervical cancer

圖2 宮頸癌HPV16E6擴(kuò)增電泳Fig．2Electrophotogram of HPV16E6amplification in cervical cancer

2．2 HPV16變異位點(diǎn)分布

擴(kuò)增目的片段E6測(cè)序波峰圖用Chromas及DNAstar軟件查看并分析序列。維吾爾族宮頸癌37例，28例測(cè)序成功，E6變異率71%（20／28），其中T350G變異率71%（20／28），178位點(diǎn)未見(jiàn)變異，發(fā)生T310G變異1例（152號(hào)），T295G變異1例（167號(hào)），A135C變異1例（167號(hào)）。

結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。

表3 28例維吾爾族子宮頸癌中HPV16E6變異情況Tab．3Variations of HPV16E6in 28cases Uighur's cervical cancer

圖3 宮頸癌HPV16E6變異位點(diǎn)波峰圖Fig．3Wave crests of HPV16E6variant sites in cervical cancer

2．3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析

根據(jù)HPV16E6序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，從圖4、5可看出，NA－1、AA、Af1與Af2變異體分支較晚，進(jìn)化較慢，一直比較穩(wěn)定，而歐洲變異體及As變異體則早早的就分支，相對(duì)不穩(wěn)定，所選維吾爾族宮頸癌樣本歐洲變異體為主。19例樣本121、132、134、138、140、142、143、149、150、152、155、164、166、167、170、175、178、183、246歸為歐洲變異體，其中9例樣本125、130、145、148、151、169、179、239、244 歸為歐洲標(biāo)準(zhǔn)體。

圖4 宮頸癌HPV16E6無(wú)根樹(shù)Fig．4Unrooted tree of HPV 16E6 in cervical cancer

圖5 宮頸癌HPV16E6有根樹(shù)Fig．5Rooted tree of HPV 16E6in cervical cancer

2．4 HPV16變異與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性

宮頸癌中HPV16變異分型與組織分化程度相關(guān)性的比較結(jié)果見(jiàn)表4。

在本實(shí)驗(yàn)中，維吾爾族宮頸癌有HPV16歐洲標(biāo)準(zhǔn)體（Ep）和HPV16歐洲變異體（E131G）2種感染，感染率分別為 32．14% （9／28）、67．86%（19／28），以HPV16歐洲變異體為主。HPV16變異體分型與組織學(xué)分化程度通過(guò)秩和檢驗(yàn)，兩者間沒(méi)有相關(guān)性（P＞0．05）。

表4 宮頸癌中HPV16變異分型與組織分化程度相關(guān)性比較Tab．4The correlation comparison between HPV16variant branch and histo－differentiation degree in cervical cancer

另外把HPV16E6 350位點(diǎn)變異與組織分化程度用秩和檢驗(yàn)比較相關(guān)性，結(jié)果兩者之間不存在相關(guān)性（P＞0．05），見(jiàn)表5。HPV16E6 350位點(diǎn)變異與年齡分組用確切概率法分析，相關(guān)性，結(jié)果兩者之間不存在相關(guān)性（P＞0．05），見(jiàn)表6。

表5 宮頸癌中HPV16E6 350位點(diǎn)變異與組織分化程度的相關(guān)性比較Tab．5The correlation comparison between HPV16E6variant of 350 site and histo－differentiation degree in cervical cancer

表6 宮頸癌中HPV16E6 350位點(diǎn)變異與年齡分組間相關(guān)性比較Tab．6The correlation comparison between HPV16E6 variant of 350siteand age groups in cervical cancer

3 討論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性癌癥中僅次于乳腺癌。在我國(guó)新疆南疆地區(qū)維吾爾族宮頸癌呈現(xiàn)民族集聚高發(fā)現(xiàn)象，其漢族發(fā)病率明顯低于維吾爾族［2］。新疆南疆維吾爾族婦女宮頸癌的患病率由527／10萬(wàn)（2004年）上升到622／10萬(wàn)（2008年）［3］，近年其發(fā)病年齡趨于年輕化［4］其發(fā)病率及死亡率在我國(guó)新疆少數(shù)民族中最高。目前宮頸癌的主要病因有已經(jīng)公認(rèn)的高危型人乳頭瘤狀病毒（High risk－h(huán)uman papilloma virus，HR－HPV）感染，另外與生活環(huán)境衛(wèi)生狀況差、多個(gè)性伴侶、多孕多產(chǎn)等環(huán)境因素和生活行為相關(guān)［5］。其中HPV致癌的重要性逐漸成為研究熱點(diǎn)。

3．1 HPV16常見(jiàn)變異位點(diǎn)及其致癌性

HPV16變異體中的某些特定位點(diǎn)的改變能增加腫瘤的易患性。大量文獻(xiàn)報(bào)道某些位點(diǎn)變異后能增加疾病的易患風(fēng)險(xiǎn)。Rubén López－Revilla等［6］在墨西哥圣路易斯發(fā)現(xiàn)1個(gè)AA變異AA－a（5．3%）及 3 個(gè) E 變 異：E－P（71．1%），E－T350G（18．4%），E－C188G（5．3%），未發(fā)現(xiàn)非洲變異體。除了E變異外，還發(fā)現(xiàn)了24處新的核苷酸改變，其中最常見(jiàn)的是A334G變異，A334G變異在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和侵襲性宮頸癌內(nèi)所占比例要高于E－P相關(guān)的其他變異。作者認(rèn)為E－P A334G變異相比于E－P原型更具有致癌性。

有研究認(rèn)為E6的T350G變異與增加宮頸疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Martha Grodzki等［7］報(bào)道在法國(guó)有 HPV持續(xù)感染（OR，2．4%；95%CI＝1．3～4．3）和進(jìn)展為高級(jí)別損傷（OR＝4．2%；95%CI＝2．1～8．1）的女性患者相比于其他高危HPV感染型更易受到HPV16的感染。值得關(guān)注的是，在隱匿有HPV16T350G變異感染的女性中，感染呈持續(xù)進(jìn)程者（OR＝3．0；95%CI＝1．4～6．7）和進(jìn)展進(jìn)程者（OR＝6．2；95%CI＝2．7～14．3）OR值明顯提高，Koji Matsumoto等［8］發(fā)現(xiàn)日本女性中 HLA DRB1＊1502與HPV16E變異D25E感染呈正相關(guān)，而HLAⅡ等位基因與L83V變異未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。這提示HPV之所以能夠持續(xù)感染除了與各民族清除病毒能力差異有關(guān)外，還與民族易感HPV變異體類(lèi)型及HPV病毒自身變異導(dǎo)致表達(dá)差異，而發(fā)生的免疫逃逸機(jī)制相關(guān)。

3．2 HPV16變異致宮頸癌機(jī)理

E6讀碼框內(nèi)第350位堿基由T變?yōu)镚，密碼子編碼的第83位氨基酸由L變?yōu)閂，T350G（L83V）突變可以導(dǎo)致重要的編碼蛋白改變，而這些改變的編碼蛋白能增強(qiáng)下游信號(hào)途徑的表達(dá)，如HPV16 E6T350G變異在宮頸癌細(xì)胞株中可以增強(qiáng)MAPK通路信號(hào)，并且協(xié)同Notch信號(hào)通路和抑制Ras介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生［9］。HPV18E6變異可激活細(xì)胞存活和擴(kuò)增中起重要作用的Akt／PKB及MAPKs信號(hào)通路［10］。

新疆所處位置是歐亞大陸結(jié)合地，而且古代的政治婚姻以及戰(zhàn)略人口遷徙、歐亞經(jīng)商比較頻繁，新疆地區(qū)民族就有47個(gè)，其中以維吾爾族和哈薩克族為主，這就為HPV形成多種變異提供了基礎(chǔ)。對(duì)于新疆維吾爾族宮頸癌變異，前期研究者已有報(bào)道［11－12］，但是都未從病毒進(jìn)化理論角度對(duì)宮頸癌中感染的HPV16變異體進(jìn)行分析研究。本實(shí)驗(yàn)建立了新疆維吾爾族宮頸癌HPV16進(jìn)化樹(shù)，從進(jìn)化理論角度更客觀對(duì)HPV16變異體進(jìn)行分析研究。發(fā)現(xiàn)維吾爾族宮頸癌以HPV16E變異體為主，且主要變異位點(diǎn)為350位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)135、295、310兩個(gè)位點(diǎn)有變異。這與前期研究者報(bào)道相似，但是這些位點(diǎn)的變異與宮頸癌的相關(guān)性及350位點(diǎn)變異的致癌機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

3．3 問(wèn)題與展望

目前，病毒致瘤學(xué)說(shuō)越來(lái)越引起大家的重視，HPV16屬于高危致瘤病毒，已被公認(rèn)為是誘發(fā)宮頸癌的危險(xiǎn)因素之一，且在美國(guó)已有HPV四價(jià)疫苗在臨床應(yīng)用，四價(jià)疫苗是針對(duì)特異片段設(shè)計(jì)，而各地區(qū)HPV變異后是否使片段失去這種特異性，而致疫苗效力下降，值得每個(gè)關(guān)心此領(lǐng)域的人重視。HPV16某些高危位點(diǎn)的變異對(duì)機(jī)體有很大的成瘤危險(xiǎn)性。而本實(shí)驗(yàn)中這些位點(diǎn)是否變異在宮頸癌中表達(dá)會(huì)出現(xiàn)何種差異，此種差異是否與宮頸癌的發(fā)生有相關(guān)性？這還需要研究者在病毒致瘤領(lǐng)域做進(jìn)一步的研究。

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