潘欣，蔡家麟，李廣波，李晗，陳龍，吳鑒今

(第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海200433)

鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhimurium，St)可引起人胃腸炎，可使鼠產(chǎn)生傷寒樣膿血癥并致死，是研究人傷寒的一種常用模式微生物［1］。該菌屬于細(xì)胞內(nèi)致病菌，其感染細(xì)胞后一個(gè)顯著特性是能夠形成一個(gè)膜性小泡(salmonella-containing vacuole，SCV)。該菌侵入細(xì)胞后，雖可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、抗菌肽等物質(zhì)殺傷胞內(nèi)菌，但該菌有數(shù)種致病基因可以使其或者在宿主細(xì)胞內(nèi)開(kāi)發(fā)自己的小生境獲取營(yíng)養(yǎng);或者干擾宿主的防御機(jī)制得以生存［2］。沙門(mén)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretion system，TTSS)將細(xì)菌的毒力因子分泌轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞［3］。沙門(mén)菌有2個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS-1和TTSS-2)［4］，其中致病島Ⅰ(salmonella pathogenesis island，SPI)編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)TTSS-1在細(xì)菌感染的最初階段發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)沙門(mén)菌與腸上皮細(xì)胞的相互作用，介導(dǎo)細(xì)菌的內(nèi)化及促炎因子的產(chǎn)生［5］。致病島Ⅱ(SPI-2)編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)TTSS-2在細(xì)菌所致的系統(tǒng)性感染中發(fā)揮重要作用，當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后，TTSS-2的效應(yīng)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的不同部位，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架及吞噬體等，這些不同的定位模式提示這些效應(yīng)蛋白可能調(diào)控宿主細(xì)胞的多種功能［6］。SPI-2系統(tǒng)可以分泌很多蛋白，其中SpiC可以與宿主細(xì)胞的Hook3相互作用而抑制SCV與溶酶體的融合［7］。宿主細(xì)胞編碼的一種NIPSNAP家族名為T(mén)assC(Target for Salmonella secreted protein SpiC，TassC)的蛋白可以與SpiC相互作用［8］，SpiC阻止含TassC囊泡募集到SCV而繞開(kāi)細(xì)胞內(nèi)的降解途徑，可以通過(guò)干擾SCV沿肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)或通過(guò)阻止攜帶細(xì)菌特異性成分的囊泡與溶酶體融合來(lái)實(shí)現(xiàn)［8］。沙門(mén)菌分泌的SifA和SseJ可以影響肌動(dòng)蛋白重組織［9］，但SpiC對(duì)細(xì)胞骨架沒(méi)有影響，卻在體內(nèi)和體外阻止囊泡之間的融合［10］。而SpiC究竟阻止哪類囊泡的融合目前還不清楚。我們?cè)l(fā)現(xiàn)TassC多抗磁珠可以結(jié)合過(guò)氧化物酶體標(biāo)志物過(guò)氧化氫酶(catalase)和可誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)［11］;最近的研究發(fā)現(xiàn)TassC定位于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體上，而過(guò)氧化物酶體和TassC在沙門(mén)菌感染后出現(xiàn)在沙門(mén)菌吞噬泡周圍。推測(cè)在感染早期，TassC結(jié)合過(guò)氧化物酶體攜帶iNOS參與殺菌機(jī)制;而隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)菌分泌至細(xì)胞的SpiC得以積累［12］，并通過(guò)與TassC的結(jié)合而阻止過(guò)氧化物酶體及其攜帶的殺菌物質(zhì)與鼠傷寒沙門(mén)菌結(jié)合，殺菌作用被抑制，使部分細(xì)菌在胞內(nèi)得以生存，感染的晚期事件還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和菌株鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 14028(以下簡(jiǎn)稱ST)購(gòu)于美國(guó)ATCC;鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器pDsRed2-Perxi和pTassC-GFP質(zhì)粒為本課題組保存;SYTO42購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;山羊抗人溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP-1)購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;FuGENE 6購(gòu)于瑞士Roche公司;Olympus IX81熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 鼠巨噬細(xì)胞過(guò)氧化物酶體和TassC的熒光標(biāo)記將鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7以3×105細(xì)胞/孔的密度平鋪于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，37℃5%CO2孵育至細(xì)胞80%匯合時(shí)，取3 μL FuGENE 6與200 μL Opti-MEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基混合，加入2 μg質(zhì)粒(過(guò)氧化物酶體組為2 μg pDsRed2質(zhì)粒;TassC組為2 μg pTassC-GFP質(zhì)粒;過(guò)氧化物酶體-TassC組為pDsRed2-Perxi和pTassC-GFP質(zhì)粒各1 μg;對(duì)照組為2 μg pcDNA 3.1-GFP質(zhì)粒)，分別混勻后室溫靜置20 min。各孔細(xì)胞分別用Opti-MEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌1次，加入FuGENE 6-質(zhì)粒混合物，并補(bǔ)充800 μL Opti-MEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃5%CO2孵育4 h后，換含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用熒光顯微鏡鑒定陽(yáng)性細(xì)胞，pD-sRed2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞名為RAW-D細(xì)胞，pTassC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞名為RAW-T細(xì)胞，pD-sRed2-Perxi和pTassC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞名為RAW-DT細(xì)胞，pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞名為RAW-G。

1.2.2 免疫染色6孔板無(wú)菌蓋玻片上的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞，染色前用PBS洗3次，加4%多聚甲醛(Polysciences)固定30 min，用PBS洗，經(jīng)含0.5%Triton X-100(Shelton Scientific)的PBS透化30 min后，再用Image-iT FX信號(hào)增強(qiáng)劑(In-

2 結(jié)果與分析

2.1 巨噬細(xì)胞TassC位于囊泡結(jié)構(gòu)中

綠色熒光蛋白在激發(fā)光譜為489 nm、發(fā)射光譜為508 nm的熒光顯微鏡下呈綠色，所用濾光片vitrogen)封閉30 min。將一抗和二抗用PBS稀釋至適當(dāng)濃度依次于室溫孵育60 min。染色并干燥后的蓋玻片用抗褪色金牌介質(zhì)(Invitrogen)在載玻片上裝片。指甲油封片。溶酶體標(biāo)志物山羊抗人溶酶體相關(guān)膜蛋白(Lamp-1)多抗或過(guò)氧化物酶體標(biāo)志物山羊抗人過(guò)氧化氫酶(catalase)多抗分別以1∶500稀釋。用鍵合了Alexa 594的驢抗山羊IgG(Invitrogen)顯色。

1.2.3 鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 14028感染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠巨噬細(xì)胞ST接種于LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)(不振蕩)。收獲細(xì)菌用不含抗生素的Opti-MEM I無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次并懸浮于該培養(yǎng)基中，加入細(xì)胞滲透性熒光染料SYTO42至終濃度為1 μmol/L，渦旋混勻后室溫孵育30 min。用不含抗生素的Opti-MEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次去除浮色，再懸浮于該培養(yǎng)基中。以10∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)的比例感染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，1 000 r/min室溫離心5 min，然后在37℃5%CO2孵箱中放置60 min，PBS洗滌3次，加4%多聚甲醛(Polysciences)固定30 min，用PBS洗。干燥后的蓋玻片用抗褪色金牌介質(zhì)(Invitrogen)在載玻片上裝片。指甲油封片。為FITC。pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光蛋白GFP散布于細(xì)胞質(zhì)中，沒(méi)有成形的結(jié)構(gòu)(圖1);pTassC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性RAW-T細(xì)胞可見(jiàn)發(fā)綠色熒光的TassC位于有形的囊泡結(jié)構(gòu)中(圖2)。

圖1 pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞示綠色熒光蛋白GFP散布于細(xì)胞質(zhì)中Fig.1 The pcDNA3.1-GFP plasmids carrying green fluorescent protein showed dispersed pattern in RAW264.7 cytoplasm

圖2 pTassC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞示發(fā)綠色熒光的TassC-GFP位于囊泡結(jié)構(gòu)中Fig.2 The pTassC-GFP plasmids carrying TassC-GFP localized in vesicular structures in RAW264.7 cells

2.2 巨噬細(xì)胞TassC與溶酶體、過(guò)氧化物酶體的關(guān)系

圖3 RAW-T細(xì)胞TassC-GFP囊泡與溶酶體無(wú)共定位Fig.3 TassC-GFP uncolocalize with lysosomal marker Lamp-1 in RAW-T cells

圖4 RAW-DT細(xì)胞TassC-GFP囊泡與過(guò)氧化物酶體共定位Fig.4 TassC-GFP colocalize with peroxisome in RAW-DT cells

RAW-T細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果顯示溶酶體標(biāo)志物L(fēng)amp-1與TassC-GFP囊泡結(jié)構(gòu)區(qū)域無(wú)共定位(圖3)，即溶酶體與TassC囊泡兩者不結(jié)合;pDsRed2-Perxi質(zhì)粒含PTS1序列，可將紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)入過(guò)氧化物酶體基質(zhì)中，pDsRed2-Perxi和pTassC-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性RAW-DT細(xì)胞中可見(jiàn)發(fā)綠色熒光的TassC-GFP可與發(fā)紅色熒光的過(guò)氧化物酶體共定位(圖4)，即過(guò)氧化物酶體可與TassC囊泡結(jié)合。

2.3 巨噬細(xì)胞TassC與過(guò)氧化物酶體聚在入侵巨噬細(xì)胞的鼠傷寒沙門(mén)菌周圍

SYTO42標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)菌感染RAW-DT細(xì)胞1 h，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)藍(lán)綠色熒光的鼠傷寒沙門(mén)菌吞噬泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)可與發(fā)綠色熒光的TassC-GFP和發(fā)紅色熒光的過(guò)氧化物酶體共定位(圖5)，且過(guò)氧化物酶體和TassC在SCV周圍集聚較多。

圖5 鼠傷寒沙門(mén)菌入侵RAW-DT招募TassC-GFP囊泡與過(guò)氧化物酶體Fig.5 TassC-GFP on peroxisome was recruitmented to the Salmonella-containing vacuole in RAW-DT cells

3 討論

沙門(mén)菌感染細(xì)胞形成的傷寒沙門(mén)菌吞噬泡SCV，其暫時(shí)獲得的早期可循環(huán)內(nèi)涵體標(biāo)志物，如早期內(nèi)涵體抗原1(Eea1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Tfr1)、Rab5和Rab11，迅速被晚期內(nèi)涵體標(biāo)志物(如空泡ATP酶和Rab7)所取代;隨后吞噬泡還會(huì)獲得溶酶體標(biāo)志物如Lamp-1(lysosome-associated membrane proteins，Lamp)，但沒(méi)有其他的溶酶體活性標(biāo)志物，如6-磷酸甘露糖、組織蛋白酶L和組織蛋白酶D等水解酶［13］。這使含有寄生菌的囊泡得以偽裝而逃逸宿主細(xì)胞的防御損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)與鼠傷寒細(xì)菌產(chǎn)生的SpiC相互作用的TassC在細(xì)菌侵入早期可以與過(guò)氧化物酶體結(jié)合，并招募過(guò)氧化物酶體聚集在細(xì)菌周圍。過(guò)氧化物酶體屬于真核細(xì)胞中的呼吸類細(xì)胞器，行使的功能十分廣泛，在脂質(zhì)代謝和過(guò)氧化氫解毒方面起重要作用。已有的研究表明，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在鼠肝細(xì)胞中定位于過(guò)氧化物酶體［14］，iNOS催化產(chǎn)生的NO˙具有重要的殺菌、抗病毒、殺傷腫瘤細(xì)胞等活性［15］。過(guò)氧化物酶體募集到吞噬泡周圍可能已經(jīng)獲得了如iNOS［14］或其他天然殺菌的催化酶，有可能在過(guò)氧化物酶體貼近吞噬泡時(shí)實(shí)現(xiàn)了iNOS的殺菌功能。TassC和過(guò)氧化物酶體及其攜帶的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在鼠傷寒沙門(mén)菌感染中晚期是否由于SpiC的大量產(chǎn)生而遠(yuǎn)離胞內(nèi)菌使之得以在胞內(nèi)繼續(xù)生存值得進(jìn)一步研究。

［1］ 潘欣.鼠傷寒沙門(mén)菌感染巨噬細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)譜［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(3):15-20.

［2］ Pan X，Tamilselvam B，Hansen EJ，et al.Modulation of iron homeostasis in macrophages by bacterial intracellular pathogens［J］.BMC Microbiol，2010，10:64.

［3］ Hueck CJ.Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62(2):379-433.

［4］ Galán JE，Ginocchio C，Costeas P.Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA:homology of InvA to members of a new protein family［J］.J Bacteriol，1992，174(13):4338-4349.

［5］ Galán JE.Interactions of Salmonella with host cells:encounters of the closest kind［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(24):14006-14008.

［6］ Shea JE，Hensel M，Gleeson C，et al.Identification of a virulence locus encoding a second type III secretion system in Salmonella typhimurium［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(6):2593-2597.

［7］ Shotland Y，Kr?mer H，Groisman EA.The Salmonella SpiC protein targets the mammalian Hook3 protein function to alter cellular trafficking［J］.Mol Microbiol，2003，49(6):1565-1576.

［8］ Lee AH，Zareei MP，Daefler S.Identification of a NIPSNAP homologue as host cell target for Salmonella virulence protein SpiC［J］.Cell Microbiol，2002，4(11):739-750.

［9］ Beuzón CR，Méresse S，Unsworth KE，et al.Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA［J］.EMBO J，2000，19(13):3235-3249.

［10］ Yu XJ，Ruiz-Albert J，Unsworth KE，et al.SpiC is required for secretion of Salmonella Pathogenicity Island 2 type III secretion system proteins［J］.Cell Microbiol，2002，4(8):531-540.

［11］ 潘欣.巨噬細(xì)胞過(guò)氧化物酶體與鼠傷寒沙門(mén)菌相互作用的初步分析［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，33(4):407-409.

［12］ Uchiya K，Barbieri MA，F(xiàn)unato K，et al.A Salmonella virulence protein that inhibits cellular trafficking［J］.EMBO J，1999，18(14):3924-3933.

［13］ Ramsden AE，Holden DW，Mota LJ.Membrane dynamics and spatial distribution of Salmonella-containing vacuoles［J］.Trends Microbiol，2007，15(11):516-524.

［14］ Loughran PA，Stolz DB，Vodovotz Y，et al.Monomeric inducible nitric oxide synthase localizes to peroxisomes in hepatocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(39):13837-13842.

［15］ Pan Xin.Expression profiles of iron metabolism-related genes in macrophages infected by Salmonella typhimurium［J］.Med J Chin PLA，2008，33(5):502-505.