雷曉凌,李學(xué)恭,佘志剛,蔡小玲,鐘敏,楊志娟
(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江524025;2.中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣東廣州510275)
海洋無脊椎動(dòng)物能在競(jìng)爭(zhēng)異常激烈的生境中繁衍生息,主要依賴于自身擁有的強(qiáng)大化學(xué)防御機(jī)制。從海洋無脊椎動(dòng)物組織里分離到的活性化合物,很多并非是這些無脊椎動(dòng)物產(chǎn)生的,而是與其共生的海洋微生物產(chǎn)生的[1]。由于許多海洋天然產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上與微生物天然產(chǎn)物極其相似,共附生于海洋無脊椎動(dòng)物的微生物一直被認(rèn)為是這些化合物真正的產(chǎn)生者[2]。近年來,從海洋環(huán)境中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質(zhì),已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[3-5]。海洋真菌由于其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性豐富、產(chǎn)量高而成為海洋天然產(chǎn)物研究的一類重要生物資源[6-7]。菌株ZH2.1是從南海一種海魚消化道中分離得到的1株真菌,其發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抗性,并具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,本文通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法,并結(jié)合18S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定和生物學(xué)研究,為進(jìn)一步研究該菌及其活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。
1.1.1 菌株菌株ZH2.1分離自南海海域白姑魚,由廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 試劑Taq聚合酶、dNTPs、瓊脂糖購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自AxyGEN公司;pMD18-T Vector購自TaKaRa公司;實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限公司。
1.2.1 培養(yǎng)基種類對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響在PDA平板、察氏平板和馬丁-孟加拉紅平板上分別點(diǎn)植菌株ZH2.1,28℃培養(yǎng)3~10 d,觀察菌落形態(tài),顏色,產(chǎn)色素情況,表面滲出物情況。培養(yǎng)基均用海水配置,并添加抑菌劑。
1.2.2 形態(tài)學(xué)分類根據(jù)菌落外部形態(tài)及孢子器、孢子梗、孢子等的形狀,結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)[8-9]初步判定其種屬。
1.2.318 S rDNA序列分析采用NS1:5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3';ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'為正反向引物(上海生工合成),以CTAB法提取菌絲體的DNA。PCR反應(yīng)體系為(25 μL):模板DNA 1.00 μL,10×PCR緩沖液2.50 μL,dNTPs(10 mmol/L)2.00 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.50 μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.30 μL,超純水18.20 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃1 min;94℃30 s,57℃60 s,72℃90 s,72℃3 min,35個(gè)循環(huán);10℃10 min。PCR產(chǎn)物回收,純化,目的DNA片段連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化JM 109感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定,挑取陽性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。DNA序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)定,將測(cè)序得到18S rDNA序列通過Blast與GenBank中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),利用Clustalx 8.0及Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。
ZH2.1菌落在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快,第5天菌落直徑達(dá)47 mm。如圖1所示,菌落最初為白色,漸變?yōu)榉奂t色,菌落反面為褐色。菌落呈圓形,平坦,后變?yōu)樾鯛?,邊緣產(chǎn)淡黃色色素。菌株在以海水配置的PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基及馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況有較大差異(表1)。
圖1 菌株ZH2.1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain ZH2.1 on PDA medium
表1 菌株ZH2.1在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征Table 1 Culture characteristics of strain ZH2.1 on different media
培養(yǎng)7~15 d,光學(xué)顯微鏡下觀察,菌絲無橫隔,分支。分生孢子器燒瓶形,有孔口,壁厚,如圖2。孢子卵圓形,有橫隔。菌絲形成厚垣孢子,近似圓形,串生。
2.3.1 菌株ZH2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增提取菌株ZH2.1的DNA并作為模板,以NS1/ITS4作為引物進(jìn)行18S rDNA擴(kuò)增,擴(kuò)增的片段為2 301 bp,見圖3。
圖2 菌株ZH2.1產(chǎn)孢器形態(tài)(15×40)Fig.2 Pycnidium morphology of strain ZH2.1 on PDA medium(15×40)
2.3.2 菌株ZH2.1系統(tǒng)發(fā)育分析以基因組DNA為模板,NS1/ITS4作為引物,PCR擴(kuò)增得到的菌株ZH2.1的18S rDNA序列全長(zhǎng)為2 301 bp,該序列已提交GenBank注冊(cè),登錄號(hào)為FJ450059。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的真菌18S rDNA進(jìn)行Blast分析,結(jié)果表明,菌株ZH2.1的18S rDNA序列與莖點(diǎn)霉屬的菌株相似性較高,根據(jù)同源性高低順序,選擇其中相似性較高的15株菌的18S rDNA序列,用ClustalX 1.8與Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知,菌株ZH2.1與孔狀短小莖點(diǎn)霉Phoma exigua var.exigua(EU167567)處于同一分支,親緣關(guān)系最近,相似性達(dá)到98%。綜合形態(tài)學(xué)觀察,培養(yǎng)特性及18S rDNA序列分析,初步鑒定菌株ZH2.1為孔狀短小莖點(diǎn)霉。
圖3 菌株ZH2.1的18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR products of strain ZH2.1 18S rDNA
圖4 基于菌株ZH2.1的18S rDNA與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the 18S rDNA of ZH2.1 and the relative strains
2.3.3 NaCl濃度對(duì)菌株ZH2.1生長(zhǎng)的影響在PDA培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl,經(jīng)過培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)菌株ZH2.1在不同濃度NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)情況差異較大,見表2。說明菌落大小和色素的產(chǎn)生與NaCl含量有關(guān);不過NaCl含量對(duì)其發(fā)酵液的抗菌活性影響不大。
表2 NaCl濃度對(duì)菌株ZH2.1生長(zhǎng)特性的影響Table 2 Effect of different concentration NaCl on the culture characteristics of ZH2.1
真菌的分類鑒定往往以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征為主,但是真菌形態(tài)特征復(fù)雜,而且環(huán)境的變化對(duì)真菌的形態(tài)特征影響較大,這可能導(dǎo)致分類系統(tǒng)的不穩(wěn)定,給分類鑒定工作帶來不便。核酸序列特異性較強(qiáng)而且穩(wěn)定,即不同親緣關(guān)系的物種核酸序列差異較大,真菌基因組中編碼核糖體的基因包括4種:28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它們?cè)谌旧w上頭尾相連、串聯(lián)排列,相互之間由間隔區(qū)分隔。它們有不同的進(jìn)化程度,有的序列比較保守,有的序列進(jìn)化較快,因此可以根據(jù)它們的序列對(duì)真菌進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。
在傳統(tǒng)的鑒定方法基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過18S rDNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,可以準(zhǔn)確有效地鑒定真菌。本文通過對(duì)分離自南海海域海魚消化道的真菌ZH2.1進(jìn)行鑒定,綜合菌落形態(tài)特征、菌體顯微特征和18S rDNA序列分析結(jié)果,初步鑒定該菌為孔狀短小莖點(diǎn)霉。此外,通過耐鹽性分析,菌株ZH2.1可以耐受較高的NaCl濃度,最高NaCl耐受濃度達(dá)15%,而且也可以在無NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),表明菌株ZH2.1是非專一性的海洋真菌。
菌株ZH2.1分離自海魚的消化道,而目前國內(nèi)外有關(guān)莖點(diǎn)霉屬的研究幾乎都來自植物病原菌[10-12],海洋真菌也僅見紅樹林內(nèi)生真菌[13],未見有從動(dòng)物中分離到莖點(diǎn)霉屬的報(bào)道,可能該菌是源于海魚的餌料。
[1] 張起輝,王彥,裴月湖.海洋微生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(8):670-678.
[2] 許靜,徐俊.海洋共附生微生物天然產(chǎn)物生物合成基因研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(7):975-979.
[3] Blunt JW,Copp BR,Hu WP,etc.Marine natural products[J].Natural Product Reports,2009,26(2):170-244.
[4] Bugni T S,Ireland C M.Marine-derived fungi:a chemically and biologically diverse group of microorganisms[J].Natural Product Reports,2004,21(1):143-163.
[5] Chen L,F(xiàn)ang YC,Zhu TJ,etc.Nine new gentisyl alcohol derivatives from marine-derived fungus Penicillium terrestre[J].Journal of Natural Products,2008,71(1):66-70.
[6] 朱偉明,王俊鋒.海洋真菌生物活性物質(zhì)研究之管見[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(2):218-228.
[7] 王祥敏,李明,駱祝華,等.海洋真菌及其生物活性物質(zhì)多樣性研究[J].海洋湖沼通報(bào),2007,(3):69-74.
[8] 中國科學(xué)院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌[M].北京:科學(xué)出版社,1973.
[9] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.
[10] 谷祖敏,紀(jì)明山,魏松紅,等.11株草莖點(diǎn)霉培養(yǎng)特征、致病力及RAPD分析[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(2):140-144.
[11] 魏生龍,王治江,于海萍,等.胡蘿卜類臘腸莖點(diǎn)霉生物學(xué)特性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(2):300-305.
[12] 柴新義,陳雙林.青檀內(nèi)生真菌菌群多樣性的研究[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(1):18-26.
[13] 吳尚英,張洋,劉愛榮,等.紅樹林植物紅海欖和秋茄的內(nèi)生真菌多樣性[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2010,27(4):489-493.