牟為，管玲玉，王啟要，劉琴，張元興

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室，上海200237)

遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda，E.tarda)是一種革蘭陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌。該菌不僅是多種淡、海水養(yǎng)殖魚類的致病菌，同時也能感染兩棲類及哺乳類等。遲鈍愛德華氏菌是目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危害的病原菌，目前已在許多種海洋魚類養(yǎng)殖中引發(fā)病害造成了巨大損失［1-2］。它的感染能引起魚類的出血性敗血病，使其出現(xiàn)腹部積水腫脹、體表出血、腸內(nèi)出現(xiàn)黏液等癥狀，稱為愛德華菌病(Edwardsiellosis)［3-5］。用化學(xué)試劑或者抗生素控制此類細菌性魚病會引起微生物的抗生素耐藥性，有害物質(zhì)殘留和環(huán)境污染等影響，因此，以預(yù)防為目的的魚用疫苗已成為防止?jié)O業(yè)病害最為有效的方法。近年來，魚用疫苗的發(fā)展相當迅速，疫苗的種類日益增多，其中多數(shù)為滅活疫苗(Killed vaccine)，也有少數(shù)減毒活疫苗(Live attenuated vaccine)和亞單位疫苗(Subunit vaccine)等［4，6-7］。魚類免疫的方法主要包括腹腔或肌肉內(nèi)注射，浸泡和口服。這3種方法在實用性和成本方面均有各自的優(yōu)缺點。注射免疫能有效利用抗原，獲得較強的免疫效果，但易使魚受傷，且費時費力，對較小的魚不適用。浸泡免疫省時方便，但疫苗進入魚體的效率和吸收效果受到多種因素限制，并且利用細菌減毒活疫苗進行浸泡免疫時，存在菌株返毒和與野生毒株發(fā)生重組導(dǎo)致新毒株出現(xiàn)的可能，有一定的安全隱患［6，8］。菌蛻(Bacterial Ghost，BG)是革蘭陰性菌被噬菌體PhiX174裂解基因E裂解后形成的。lysisE基因并不導(dǎo)致宿主細胞完全裂解，而是引起細胞膜出現(xiàn)孔道，使得細胞內(nèi)容物經(jīng)由裂解孔道排出，形成不含核酸、核糖體及其他組分的幾乎完好無損的空殼細胞［9-11］。傳統(tǒng)的菌蛻系統(tǒng)是在溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)PI/pR-cI857轉(zhuǎn)錄控制下形成E基因的可控表達，當溫度低于30℃時，熱敏感阻遏蛋白cI857的表達使基因E能被穩(wěn)定抑制，細菌正常生長;溫度高于30℃時，因阻遏蛋白cI857的熱失活而使基因E開始表達，細菌裂解形成菌蛻，在42℃時細菌的裂解達到最佳狀態(tài)。鐵是一種重要而必需的過渡金屬元素，幾乎所有的生物體都需要游離鐵離子來進行呼吸作用和氧運輸?shù)?，但是過量的鐵也會造成機體損傷［12-13］。因此，微生物在進化過程中生成了多種調(diào)控系統(tǒng)以嚴格控制鐵元素的攝取和釋放。多數(shù)細菌鐵攝取系統(tǒng)在鐵豐富的環(huán)境中并不表達，主要原因是其編碼基因的-35至-10區(qū)通常存在著一個Fur蛋白結(jié)合盒(Fur box)。Fur是一種鐵依賴性的全局調(diào)控因子(Global regulator)，存在于各種細菌鐵攝取系統(tǒng)，在大腸埃希菌中超過90種基因的表達受Fur調(diào)控。其中35種與鐵攝取相關(guān)的基因在富鐵環(huán)境中受Fur嚴格抑制，保證鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)受到鐵濃度的嚴格調(diào)控［14-16］。本研究利用受鐵濃度調(diào)控的啟動子PyncE［15，17］來構(gòu)建新型的遲鈍愛德華氏菌菌蛻系統(tǒng)，研究并比較其裂解效率、制備條件、菌體形態(tài)與傳統(tǒng)菌蛻的區(qū)別，為進一步研究高效的菌蛻疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒E.coli Top10F'為本實驗室保藏，含有大質(zhì)粒pEIB202的E.tarda EIB202菌株為本實驗室前期分離得到，所有菌株于-80℃保存于含20%甘油的LB培養(yǎng)基中。商業(yè)化原核表達質(zhì)粒pUC18、pBV220為本實驗室前期購買保藏(Invitrogen)，菌蛻質(zhì)粒pPR-cI-Elysis為Lubitz W教授惠贈。

1.1.2 主要試劑本實驗所需的常規(guī)化學(xué)試劑主要采購自中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司。限制性內(nèi)切酶SalⅠ、HindⅢ以及PCR所用DNA聚合酶(Pyrobest DNA polymerase)、DNA連接試劑盒(DNA ligation kit 2.0)均購自寶生物(TaKa-Ra)，普通Taq酶預(yù)混反應(yīng)液(2×Taq Marster Mix)及質(zhì)粒抽提、膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒均購自天根生化(Tiangen，北京)。

1.1.3 主要儀器電泳儀、瓊脂糖電泳槽、iCycler PCR反應(yīng)儀以及酶標儀購自BIORAD公司;FR-200紫外與可見分析裝置購自上海復(fù)日生物工程公司;掃描電子顯微鏡(Hitachi S-2400)購自O(shè)lympos公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建常規(guī)DNA技術(shù)操作參照文獻［18］進行，所用引物見表1。裂解基因lysisE通過PCR從PhiX174基因簇上得到，PR-cI857調(diào)控系統(tǒng)從質(zhì)粒上獲得，鐵調(diào)控啟動子PyncE及其上游序列來源于E.coli TOP10基因組。用overlap PCR的方法分別將兩類啟動子與lysisE基因融合，擴增出的融合片段PR-E和PyncE-E用SalⅠ、HindⅢ酶切到表達質(zhì)粒pUC18中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別命名為LPR-E/pUC18和PyncE-E/pUC18。

1.2.2 遲鈍愛德華氏菌菌蛻制備及檢測將上文構(gòu)建的2種質(zhì)粒LPR-E/pUC18、PyncE-E/pUC18電轉(zhuǎn)化至E.tarda EIB202感受態(tài)細胞，得到的陽性菌株接種于含有Ampr抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28℃200 r/min搖床過夜培養(yǎng);次日，2重組

表1 所用引物列表Table 1 Primers used in this study

1.2.3 掃描電鏡觀察將誘導(dǎo)后生成的E.tarda菌蛻用2.5%戊二醛4℃固定2 h后用PBS洗滌3次，經(jīng)乙醇逐級脫水和醋酸異戊脂置換等步驟處理后，將細胞進行冷凍干燥，用含銀離子的包埋劑處理后即可進行掃描電鏡(Hitachi S-2400)觀察。

2 結(jié)果與分析

圖1 融合片段PR-E和PyncE-E的overlap PCR擴增產(chǎn)物驗證Fig.1 Overlap PCR amplification of PR-E and PyncE-E

分別以菌蛻質(zhì)粒pPR-cI-Elysis和E.coli Top10F'染色體DNA為模板，利用PCR擴增出裂解基因lysisE、溫度誘導(dǎo)啟動子PR和鐵調(diào)控啟動子PyncE(圖1)，膠回收純化后的產(chǎn)物進行重疊延伸(overlap)-PCR，得到融合片段LPR-E和PyncEE。將融合片段經(jīng)酶切SalⅠ、HindⅢ后連接到pUC18中，構(gòu)建重組質(zhì)粒LPR-E/pUC18和PyncEE/pUC18。將連接液電轉(zhuǎn)化入E.tarda EIB202，并對其轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，分別出現(xiàn)1 543 bp和874 bp的條帶，其結(jié)果跟預(yù)期的一致，測序后發(fā)現(xiàn)無突變堿基，說明重組質(zhì)粒LPR-E/pUC18、PyncE-E/pUC18已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化進入E.tarda EIB202中。

2.2 菌蛻系統(tǒng)生成效率檢測

圖2 菌蛻系統(tǒng)對E.tarda的溶菌過程Fig.2 Growth curves of E.tarda harboring plasmidPyncE-E/pUC18 or PR-E/pUC18

將重組菌株E.tarda EIB202(LPR-E/pUC18)在28℃培養(yǎng)至對數(shù)中期，將菌株在42菌株分別轉(zhuǎn)接種于30 mL Ampr抗性的LB液體中，28℃200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600為0.3～0.5時，將含有PR-E/pUC18的菌株移至42℃搖床中培養(yǎng)，在含有PyncE-E/pUC18的菌株加入鐵離子螯合劑二聯(lián)吡啶后繼續(xù)28℃培養(yǎng)。自此，每30 min取樣，測OD600的吸光度值，直到誘導(dǎo)后培養(yǎng)物的OD600趨于平穩(wěn)為止。

2.1 菌蛻系統(tǒng)構(gòu)建

℃環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)lysis E表達。如圖2A所示，細菌在繼續(xù)生長一段時間后開始裂解，在溫度升高后1.5 h，可檢測到OD600開始下降，OD600的檢測數(shù)值從0.92持續(xù)下降到0.48，至誘導(dǎo)后4 h開始趨于平穩(wěn)。同樣，將重組菌株E.tarda EIB202(PyncE-E/pUC18)在28℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，在培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑二連吡啶誘導(dǎo)lysisE表達。結(jié)果如圖2B顯示，誘導(dǎo)后菌株即停止生長。這說明E蛋白能夠在2套ghost系統(tǒng)中正常表達，并對宿主菌E.tarda EIB202產(chǎn)生致死或抑制其生長的作用。隨后的菌落涂板實驗也證實實際活菌數(shù)量與OD600所顯示情況相符。

2.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察如圖3所示，大多數(shù)傳統(tǒng)菌蛻E.tarda EIB202(LPR-E/pUC18)在誘導(dǎo)后生成空泡狀結(jié)構(gòu)，細菌的細胞兩極可見直徑之間的溶菌孔道和部分胞內(nèi)物質(zhì)，說明E蛋白能夠融合在遲鈍愛德華氏菌的形成特異性跨膜通道，并使得細菌內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，從而使內(nèi)含物流出。而新型菌蛻E.tarda EIB202(PyncE-E/pUC18)誘導(dǎo)后的細菌有一些并未全部裂解或形成孔道結(jié)構(gòu)，僅有部分形成了致死的菌蛻細胞，但由于胞內(nèi)壓力和部分胞內(nèi)物質(zhì)被溶解等原因，鐵誘導(dǎo)表達系統(tǒng)介導(dǎo)的菌蛻使細菌表面形態(tài)有明顯的皺縮和拉長等現(xiàn)象。

圖3 掃描電鏡觀察菌蛻形成情況Fig.3 Scanning electron micrograph of E.tarda ghost

3 討論

菌蛻作為新型非活性疫苗，能夠保持與活細菌相同的完好形態(tài)結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，包括黏膜免疫，并且不具有活菌疫苗的致病作用［9］。同時，由于菌蛻保留有細菌的菌毛、纖毛，具有生物親和性，能夠進行特異的細胞和組織定位，可用作核酸和藥物的親和性載體。利用菌蛻系統(tǒng)作為抗原載體接收大量的外源抗原或重組蛋白，將這些抗原蛋白通過特定的膜錨定結(jié)構(gòu)插入細胞膜，或填充于胞周間隙和細胞空腔中，可以獲得重組菌蛻多價苗和多聯(lián)苗［19-20］。之前的研究表明，細菌菌蛻特別適合作為黏膜免疫的疫苗運送系統(tǒng)，通過口服途徑也可激發(fā)體液和細胞免疫應(yīng)答［21-23］，但由于傳統(tǒng)的菌蛻生成調(diào)控系統(tǒng)是依靠溫度調(diào)控，因此，該系統(tǒng)要求在30℃以下的條件進行細菌的培養(yǎng)，而許多病原菌在這一溫度培養(yǎng)時很難達到正常的生長。因而，開發(fā)新型的可調(diào)控系統(tǒng)將有利于菌蛻疫苗的生產(chǎn)。

本研究利用細菌在生長過程中嚴格受鐵調(diào)控這一特性，挑選出一個鐵調(diào)控型啟動子PyncE，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了新型的鐵調(diào)控菌蛻系統(tǒng)。因為在細菌普通培養(yǎng)基LB中含有豐富的游離鐵離子，正常培養(yǎng)時受Fur蛋白調(diào)控的PyncE在豐富鐵環(huán)境下不表達裂解lysisE基因，而當培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑后，因為鐵離子缺乏，PyncE開啟轉(zhuǎn)錄表達，使得細菌裂解。

與傳統(tǒng)菌蛻受到誘導(dǎo)后大量死亡不同，鐵調(diào)控菌蛻能夠讓宿主菌在誘導(dǎo)后保持低密度生長。

電鏡結(jié)果表明，鐵調(diào)控菌蛻除生成孔洞外，還有一些因內(nèi)部裂解壓力而發(fā)生拉伸，細菌分化不完全等現(xiàn)象，這可能與PyncE與LPR啟動效率不同有關(guān)，說明在不同的啟動子調(diào)控下，菌蛻會出現(xiàn)不同的形式。目前，利用細菌菌蛻作為抗原呈遞載體已成為疫苗開發(fā)的熱點，本實驗中構(gòu)建新型的調(diào)控系統(tǒng)，使得細菌在維持少量生存的情況下形成菌蛻，對以后遲鈍愛德華氏菌菌蛻疫苗及載體疫苗的開發(fā)和設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。

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