孫丹丹，馬笑雪，胡建，羅恩杰

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物學教研室，遼寧沈陽110001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，為一種革蘭陽性球菌，廣泛存在于人與動物的皮膚、黏膜及外界環(huán)境中，可以引起人類多種疾病，包括常見的癤、癰、膿皰病、蜂窩組織炎、中耳炎、各種部位的術后感染和累及深部組織的肺炎、骨髓炎、心肌炎、腦膜炎、心內膜炎、食物中毒、各種臟器的深部膿腫還有累及全身的菌血癥、毒素休克綜合癥等多種疾病，不但感染范圍廣，而且感染率高［1-4］。甲氧西林進入臨床使用后不久就出現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)不僅是院內感染的重要病原菌，在社區(qū)人群中也是重要的感染源［5-7］。MRSA常常呈多重耐藥性，易造成醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，已成為臨床抗感染治療的一大難題［8-9］。MRSA對甲氧西林耐藥的機制主要是它獲得了外源性甲氧西林耐藥決定子A(methicillin-resistancedeterminantA，mecA)，該基因能夠編碼與β-內酰胺類親和力極低的青霉素結合蛋白2a，從而對β-內酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。mecA基因存在于葡萄球菌盒式染色體(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)中，SCCmec是一種可移動的遺傳元件，該元件還攜帶除mecA基因外的其他抗菌藥物的耐藥基因，造成多重耐藥(Multidrug-resistance，MDR)。SCCmec目前主要分為8型，其中又分為若干亞型。SCCmec的基因型與MRSA的流行背景有關，不同地區(qū)的SCCmec基因分型分布可能不同［10-14］。SCCmec元件的組織結構和所含的遺傳因子具有高度多樣性，SCCmec元件已經(jīng)被分類為不同的型和亞型。SCCmec元件的許多型、亞型、變型以及缺少mecA基因的SCCmec元件都有報道。本文對SCCmec元件的基本特性及其研究新進展加以描述。

1 SCCmec元件的特點

β-內酰胺是應用到臨床實踐的首選抗菌藥，是目前臨床上使用最為有效的抗菌藥物之一。甲氧西林，是1960年引進的一種半合成的青霉素，專門用于治療產(chǎn)β-內酰胺酶的葡萄球菌引起的感染［14］。然而，甲氧西林引入臨床應用不到1 a，在臨床感染的病例中發(fā)現(xiàn)了首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)［15］。MRSA菌株可以產(chǎn)生一種新的青霉素結合蛋白PBP2a(PBP2')，PBP2a(PBP2')降低了與β-內酰胺類抗生素的親合力，從而對β-內酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性。PBP2a(PBP2')由mecA基因編碼，mecA基因位于葡萄球菌盒式染色體上(SCCmec)。根據(jù)SCCmec所含J區(qū)不同將其分為不同的亞型［16-19］。SCCmec的分型被用來作為檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子流行病學的依據(jù)。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的產(chǎn)生是由甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)獲得外源性的SCCmec所致。SCCmec有不同的型和亞型，但都擁有幾個共同的特點:①保守的末端反向重復序列和整合點處的正向重復序列;②mec基因復合體;③mecA基因上下游存在的保守的基因結構以及負責SCCmec移動的染色體盒重組基因(cassette chromosome recombinase，ccr)［20-21］。

2 SCCmec元件分類的基本概念

根據(jù)mec基因復合體和ccr基因復合體組成的不同，SCCmec可以分成不同的基因型別。mec基因復合體和ccr基因復合體是SCCmec元件的主要組成成分，分別負責SCCmec元件的整合和切除以及β-內酰胺耐藥表型。

2.1 mec基因復合體

mec基因復合體包含mecA基因、調節(jié)基因和插入序列。class A mec基因復合體(class A mec)是復合體的原型，包括mecA基因、位于其上游的調節(jié)基因(mecR1)和抑制基因(mecI)、高變區(qū)(HVR)和位于其下游的插入序列IS431。class B mec基因復合體包括mecA基因、殘缺的mecR1基因由于在mecA基因上游插入IS1272，高變區(qū)和mecA基因下游的IS431序列。class B mec基因復合體包括mecA基因、殘缺的mecR1基因(由于在mecA基因上游插入IS1272序列所致)、高變區(qū)和mecA基因下游的IS431序列。class C mec基因復合體包括mecA基因、缺失的mecR1基因(由于在mecA基因上游插入IS431序列而產(chǎn)生)、高變區(qū)和mecA基因下游的IS431序列。有2種不同的class C mec基因復合體;class C1 mec基因復合體的mecA基因上游的IS431序列與mecA基因下游的IS431序列(緊靠著HVR)有相同的方向，然而class C2 mec基因復合體的mecA基因上游的IS431序列的方向是逆轉的。C1和C2被視為是不同的mec基因復合體，因為它們很可能是獨立的變異體。class D mec基因復合體包含mecA基因和ΔmecR1基因，但是在ΔmecR1基因下游沒有插入序列［14-15，22-24］(表1)。

mec基因復合體存在以下特點:①只存在于MRSA中，MSSA缺乏;②不是MRSA所固有的，是染色體上一個外來的插入片段;③不同MRS的mecA基因復合體片段末端都存在相同的插入性重復片段，且插入位置均在SmaI-G段上編碼A蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合成必須的purA基因之間，表明mecA基因復合體的整合具有位置和方向的特異性;④mec基因復合體片斷不穩(wěn)定，其大到100 kb的片段(包括spa基因)均可以丟失［25-26］。

在通常情況下，mecA基因受阻遏蛋白MecⅠ和跨膜的β-內酰胺信號轉導蛋白MecRⅠ調控。當沒有β-內酰胺類抗生素存在時，MecⅠ抑制mecA和mecRI-mecⅠ的轉錄;當β-內酰胺類抗生素存在時，MecRⅠ從胞內段自動催化分裂出具有活性的非金屬蛋白酶結構域，后者去除MecⅠ對mecA的阻遏作用，使mecA基因能夠轉錄而產(chǎn)生PBP2a［27］。mecA基因廣泛分布于葡萄菌屬的多個種中，有人推測其可能存在于一個可移動的遺傳元件上，可以在葡萄菌屬的多個種中很容易地進行轉移。

表1 主要的mec復合體Table 1 The major classes of mec complexes

2.2 ccr基因復合體

ccr基因復合體由ccr基因和其周圍的開放閱讀框架組成(ORFs)。目前，在金黃色葡萄球菌中經(jīng)鑒定有3個譜系不同的ccr基因，ccrA、ccrB和ccrC。迄今為止，ccrA和ccrB基因經(jīng)鑒定分為4種異型，而ccrC只有一種［28］。

ccr復合物包括2個位點特異性重組酶基因ccrA和ccrB，其中位點特異性重組酶CcrA和CcrB通過位點特異性重組作用，可以使多種耐抗生素和耐重金屬基因嵌入到SCCmec中;同時不同類型的重組酶CcrA和CcrB識別相應的SCCmec，通過精確的切除和整合作用，使SCCmec整合到葡萄球菌屬的染色體上，使不同的葡萄球菌能交換基因信息，適應不同環(huán)境和抗生素選擇壓力。在金黃色葡萄球菌中，根據(jù)ccrA和ccrB基因的不同，ccr復合物分成5型:1型(type1)攜帶ccrA1B1基因，2型(type2)攜帶ccrA2B2基因，3型(type3)攜帶ccrA3B3基因，4型(type4)攜帶ccrA4B4基因，5型(type5)攜帶ccrC基因［15，29-30］。應用特定的引物并通過常規(guī)的PCR分析技術都可以檢測出它們的型別。

2.3 J區(qū):mec和ccr基因復合體以外的區(qū)域

除了mec和ccr基因復合體外，SCCmec元件還包含3個J區(qū)，它構成盒子非必需的部件。這些區(qū)域可能攜帶其他的抗生素抗藥性決定簇，起初被稱為L-C，C-M，和I-R區(qū)域，但是不久后就改稱為J區(qū)。J1(從前的L-C區(qū))是位于染色體右側的區(qū)域和ccr復合體之間的區(qū)域，J2(C-M)是位于ccr基因復合體和mec基因復合體之間的區(qū)域，J3(I-R)是位于mec基因復合體和染色體左側的區(qū)域之間的區(qū)域。J區(qū)和mec-ccr復合體一樣，它的許多變異體被用來定義SCCmec亞型［31］。

3 8種當前已確定的SCCmec類型

迄今為止，按照(圖1，表2)所使用的標準金黃色葡萄球菌已有8種SCCmec類型。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ這3種SCCmec元件是最先發(fā)現(xiàn)的［26，32］。隨后又報道了Ⅳ至Ⅷ型的SCCmec［22-23，28，30，33］。但是另外的一個命名新型SCCmec元件的系統(tǒng)，是按照ccr和mec復合體的不同組合進行分類的，例如，Ⅰ型(1B)SCCmec表明SCCmec包含ccr1和class B mec基因復合體。其他所知道的SCCmec類型有Ⅱ型(2A)、Ⅲ型(3A)、Ⅳ型(2B)、Ⅴ型(5C2)、Ⅵ型(4B)、Ⅶ型(5C1)和Ⅷ型(4A)。因此，SCCmec的類型應該按照它們被發(fā)現(xiàn)的順序使用羅馬體數(shù)字來命名，然后括號里標注上ccr和mec基因復合體的類型(表2)。

據(jù)報道Ⅲ型SCCmec元件長度為67 kb，被認為是最長的SCCmec元件［30］。然而，2006年，有報道稱這個67 kb的元件是由2個小的SCC元件合成的;是由SCCmercury和Ⅲ型(3A)SCCmec(攜帶ccr3和class A mec)整合在一起組成的［29，32］。為了避免使SCCmercury與SCCmec混淆，其先前的名字被改為SCCHg。金黃色葡萄球菌HDE288攜帶的SCCmec元件是首次報道Ⅳ型SCCmec元件的菌株［34］，但是被重新定義為Ⅵ型SCCmec(4B)［28］。

SCCmec各型的發(fā)現(xiàn)年代如下:1961年英國ccr基因復合體由ccr基因和其周圍的開放閱讀框架組成(ORFs)。目前，在金黃色葡萄球菌中經(jīng)鑒定有3個譜系不同的ccr基因，ccrA、ccrB和ccrC。迄今為止，ccrA和ccrB基因經(jīng)鑒定分為4種異型，而ccrC只有一種［28］。

ccr復合物包括2個位點特異性重組酶基因ccrA和ccrB，其中位點特異性重組酶CcrA和CcrB通過位點特異性重組作用，可以使多種耐抗生素和耐重金屬基因嵌入到SCCmec中;同時不同類型的重組酶CcrA和CcrB識別相應的SCCmec，通過精確的切除和整合作用，使SCCmec整合到葡萄球菌屬的染色體上，使不同的葡萄球菌能交換基因信息，適應不同環(huán)境和抗生素選擇壓力。在金黃色葡萄球菌中，根據(jù)ccrA和ccrB基因的不同，ccr復合物分成5型:1型(type1)攜帶發(fā)現(xiàn)Ⅰ型SCCmec，也是第1株MRSA(NCTC10442)發(fā)現(xiàn)的年代;1982年日本發(fā)現(xiàn)Ⅱ型SCCmec，MRSA N315;1985年新西蘭發(fā)現(xiàn)Ⅲ型SCCmec，MRSA 85/2082;于20世紀90年代發(fā)現(xiàn)了不同的克隆Ⅳ型SCCmec;于2004年澳大利亞發(fā)現(xiàn)Ⅴ型SCCmec［23］;于2006年葡萄牙發(fā)現(xiàn)Ⅵ型SCCmec［28］;Ⅶ型SCCmec2007年發(fā)現(xiàn)于臺灣［35］。2008年在加拿大發(fā)現(xiàn)Ⅷ型SCCmec［22］。隨著研究的不斷深入，以后可能還會有更多的新型的SCCmec被發(fā)現(xiàn)。

8種類型的SCCmec從20.9～66.9 kb，大小不等:Ⅰ(34.3 kb)、Ⅱ(53.0 kb)、Ⅲ(66.9 kb)、Ⅳ(20.9～24.3 kb)、Ⅴ(28 kb)、Ⅵ(20.9 kb)、Ⅶ(35.9 kb)、Ⅷ(32 kb)。Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ僅對β-內酰胺類抗生素耐藥，而Ⅱ和Ⅲ則引起多重耐藥，后兩者起因于多種附加耐藥基因整合入

表2 金黃色葡萄球菌中的SCCmec類型Table 2 SCCmec types identified in S.aureus

4 SCCmec亞型的分類

在主要的SCCmec類型中，mec基因復合體和ccr基因復合體以外的區(qū)域發(fā)現(xiàn)了許多不同的結構(包括插入序列和轉座子)，例如在J區(qū)。因此，根據(jù)J區(qū)的多態(tài)現(xiàn)象及ccr基因復合體和mec基因復合體的結合類型的變異，SCCmec的每種類型已經(jīng)更深入地被分類到了亞型［31］。為了避免將新型的SCCmec原件錯分類到原有的型或亞型的可能，新型的SCCmec原件的報告應該以這個原件的整個核苷酸序列為依據(jù)，而不單是依據(jù)PCR產(chǎn)物的大小，這樣是會令人誤解的。因此，新的SCCmec亞型應該被定義根據(jù)J區(qū)上存在的特殊的DNA序列，包括(i)J區(qū)上特有的基因、擬基因或非編碼區(qū)，除了J區(qū)上可動的遺傳因子;(ii)可動的遺傳因子，如插入序列、質粒、轉座子，它們中的大多數(shù)編碼耐藥的或其他決定子。

迄今為止，有3種方法描述SCCmec原件的亞型:(i)由于J1區(qū)的不同，用小寫字母表示亞型，例如Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc;(ii)由于可動的遺傳因子的存在或缺失而產(chǎn)生的不同，用大寫字母表示，例如ⅠA、ⅡA和ⅣA;(iii)由于J1、J2和J3是按照發(fā)現(xiàn)的順序而產(chǎn)生的不同，用阿拉伯數(shù)字表示，例如Ⅱ.1.1.1、Ⅱ.1.1.2和Ⅱ.2.1.1。(i)和(ii)這2種命名方法被保留作為通用命名方法［14］。

5 2個或多個SCC原件的組合

近來，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)有的SCCmec原件攜帶2個ccr基因復合體。例如，金黃色葡萄球菌ZH47株攜帶的SCCmec是由1個含ccrC的SCC和1個攜帶class B2 mec基因復合體的SCCmec(class Bmec基因復合體的亞類，整合在Tn4001轉座子上)及1個2型的ccr基因復合體和與IVc型SCCmec有同源性的J1區(qū)共同組成的［37］。雖然這2種SCC原件是串聯(lián)排列的，但是對應ISS序列的特征性的DR序列在鏈接區(qū)域沒有被鑒定出來，經(jīng)鑒定2個DR序列位于復合元件的末端，表明1個單個的SCCmec包含2個ccr基因復合體。其他的實例包括臺灣的TSGH17和PM1這2株金黃色葡萄球菌所攜帶的SCCmec原件也是這樣的［35，38］。這些SCCmec原件是由1個攜帶含等位基因8的ccrC1的SCC和1個攜帶class C2 mec基因復合體的SCCmec，攜帶含等位基因2的ccrC1的5型ccr基因復合體，SCCmec特有的J1區(qū)和2端的DR序列共同組成的。經(jīng)鑒定當1個合成的SCC原件攜帶2個ccr基因時，ccr基因、SCCmec［22，28，35］。然而，新發(fā)現(xiàn)的Ⅷ型SCCmec的J2區(qū)與Ⅱ和Ⅲ的高度相似，攜帶紅霉素A等耐藥基因［22］。SCCmecⅣ和Ⅴ型基因盒較短，除了攜帶mecA基因外幾乎不帶有其他耐藥基因，對非β-內酰胺類的抗菌藥物敏感［33］。攜帶Ⅰ型的菌株為原型株，含耐藥基因相對較少，除對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥外對其他抗菌藥物敏感，多藥耐藥率低。Ⅱ型菌株攜帶的耐藥基因較Ⅰ型多，除攜帶β-內酰胺類抗菌藥物耐藥基因外，其SCCmec基因盒還存在攜帶氨基糖苷類耐藥基因的PUB110質粒和攜帶紅霉素耐藥基因的Tn554轉座子。Ⅲ型SCCmec是含耐藥基因種類最多的一種類型，包括φTn554編碼鎘抗性，pT181編碼四環(huán)素抗性，mer編碼汞抗性，Tn554編碼紅霉素和大觀霉素抗性等基因。故Ⅱ、Ⅲ型菌株表現(xiàn)為多藥耐藥［32，36］。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的SCCmec存在于醫(yī)院獲得MRSA(H-MRSA)中。Ⅳ和Ⅴ型SCCmec基因盒較短，除了攜帶mecA基因外幾乎不帶有其他耐藥基因，僅表現(xiàn)為對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥。Ⅳ和Ⅴ型SCCmec基因盒主要存在于社區(qū)獲得性MRSA(C-MRSA)中，由于其長度較短，相對輕便，更易在不同遺傳背景的流行株中發(fā)生轉移，所以往往造成大的暴發(fā)流行［23］。此外，SCCmec還攜帶插入序列，如IS431和IS1272，調控mecA的轉錄，即ΔmecR1或者mecR1和mecI的轉錄;IS431和IS1272均能截斷mecI和mecR1，從而導致mecA基因的去阻遏作用［36］。mec基因復合體、J區(qū)綜合的復合物應該與先前所描述的進行對比，以便確定其是否隱藏任何SCCmec現(xiàn)存的類型。此外，SCCmec原件與額外的ccr基因的聯(lián)合應該被用來鑒定是否這2個ccr基因的存在是由于2個獨立的SCC元件整合所引起的，又或者這個復合體是由于含有DR序列的ISS序列的初始結合區(qū)域缺失的2個元件的融合而產(chǎn)生的［14，39］。

最后，金黃色葡萄球菌的ZH47的元件被分類為Ⅳ型SCCmec元件(2B＆5)，金黃色葡萄球菌的TSGH17和PM1的元件被分類為Ⅴ型SCCmec元件(5C2＆5)，即使PM1的原件暫時已經(jīng)有報道為Ⅶ型SCCmec［22］。根據(jù)擬定的標準線，金黃色葡萄球菌HU25菌株攜帶的SCCmec被報道為ⅢA型SCCmec，它應該是2個SCC元件的一個合成物，這2個SCC元件為SCCHg和Ⅲ型SCCmec［40］，因為在2個元件的接合處攜帶特殊的核苷酸序列的這個區(qū)域被刪除而且僅含有2個DR序列，一個位于orfX的下游，另一個在Ⅲ型SCCmec末端的右側，這些是可以被檢測到的［34］。

或許許多這樣的復合元件將被發(fā)現(xiàn)，因為原始的接合區(qū)域的缺失似乎頻繁的發(fā)生。使用當前的PCR技術對SCCmec分型的方法，從2個元件串聯(lián)后的結構存在來辨別復合元件的存在那是很難的。因此，新型元件攜帶2個ccr基因不應該給予1個羅馬數(shù)字作為一個新的類型，但是根據(jù)復合元件中現(xiàn)在已知的SCCmec類型應該作為1個SCCmec類型的變異體。

6 不含mecA的SCC元件的分類

經(jīng)鑒定在葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了不攜帶mecA基因的SCC元件，但是它攜帶其他特殊的基因(例如，莢膜基因簇、夫西地酸耐藥基因、汞抗性操縱子)。這些元件都具有SCCmec的特征:在ccr基因復合體內攜帶1個ccr基因(ccrAB或ccrC);整合在葡萄球菌染色體的ISS;位于DR序列的側面。

在命名SCC元件時可以在其詞尾加上基因的名字或是它們的功能。例如，SCCcap1攜帶1型莢膜基因簇，SCCfur攜帶夫西地酸耐藥基因，SCCHg攜帶汞抗性操縱子。如果在SCC中沒有發(fā)現(xiàn)這些推理功能的基因，那么就在命名SCC元件時在詞尾加上菌株的名字，如，SCC476［14］。

此外，葡萄球菌中也包含SCC-相似區(qū)域，與SCC相似整合到ISS上并包含在ISS內，但是與SCC不同之處是不含有ccr基因。它們大小不同，從最小的(0.1 kb)到最大的(34 kb)，都以不同的方式被描述過，例如，SCC-相似元件，是一個分解代謝精氨酸的移動元件，一個染色體盒，或是一個SCCmec基因組插入位點序列［30］。建議稱這些元件為假的SCC元件(ψSCC)。認為這些與SCC相似的ψSCC元件應該被指定在詞尾增加基因的名字或是它們的功能或是加上菌株的名字來進行描述。在某些情況下，這些ψSCCs與SCCmec元件以串聯(lián)的方式整合在一起，作為金黃色葡萄球菌的一個外源DNA簇基因組序列區(qū)域［20］。

7 結語

SCCmec盒式染色體是一種新型的可移動元件，大小為21～67 kbp，該元件主要包括mec基因復合體和染色體重組酶基因ccr復合體。根據(jù)mec和ccr基因復合體結構不同，可將SCCmec主要分為8種基因型。SCCmec可自主從染色體上切除，切除后形成的環(huán)狀體，以適當方式轉移到其他葡萄球菌菌株后，可再次重組到受體菌染色體中，使受體菌獲得抗藥性。SCCmec既可使耐藥基因在菌株之間水平傳播，也可使耐藥基因疊加而使耐藥譜擴大，從而使SCCmec型別具有高度多態(tài)性的同時不斷有新的型別產(chǎn)生。SCCmec基因型與MRSA流行背景有關，也可能呈現(xiàn)地區(qū)性差異，不同的遺傳背景的克隆株攜帶的SCCmec也可能不同，對SCCmec進行基因分型也可追蹤其來源。

用適當?shù)腜CR技術為基礎，鑒定SCCmec元件的型別對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的流行病學特征和對SCCmec元件進行分類的研究具有重要的意義。

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