(1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四平 136000； 2.長春師范學(xué)院，長春 130032)

紅景天為景天科(Crassulaceae)植物大花紅景天屬(Rhodiola S achalinensis L.)的干燥根及根莖,它是在青藏高原海拔3 400～5 700 m純凈無污染環(huán)境下生長的一種珍貴藥用植物。紅景天的藥理學(xué)研究及臨床實(shí)踐表明,其具有較好的抗疲勞和抗缺氧[1,2]、抗微波輻射[3]、抗腫瘤[4]、解毒、提高人體免疫力[5]、增強(qiáng)記憶力、強(qiáng)心活血[6,7]、平衡血糖等作用，是人體細(xì)胞的潛能激活劑，對人體神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有極好的整體調(diào)理作用。紅景天的有效成分為紅景天苷(Salidroside，結(jié)構(gòu)式如圖1)，紅景天苷常被用來評價(jià)紅景天屬植物的藥用價(jià)值，是迄今為止研究最多的有效成分之一[8]。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道利用HPLC法測定紅景天中紅景天苷的含量[9-13]，但是利用熒光光譜法測定紅景天中紅景天苷的含量尚未見報(bào)道。筆者建立了測定紅景天苷的熒光光譜方法，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 紅景天苷的分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光光譜儀:RF-5301PC型,日本島津公司；

分光光度計(jì):Shimadzu UV-1700型,日本島津公司；

數(shù)字酸度計(jì)：pHS-3C型,杭州東興設(shè)備儀器廠；

紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品：編號110818-200404，中國藥品生物制品檢定所；

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 溶液的配制

紅景天苷溶液：稱取適量的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解后定容于10 mL容量瓶中，濃度為5×10-4mol/L。

不同pH值的Britton-Robinson緩沖液：將1.33 mL磷酸、1.18 mL冰乙酸和1.24 g硼酸(用適量水溶解)混合后定容于500 mL容量瓶中，該酸混合液(A液)中酸的濃度約為0.04 mol/L；稱取4.0 g NaOH，用水溶解后定容于500 mL的容量瓶中，則該堿液(B液)中堿的濃度約為0.20 mol/L；將A液和B液按一定比例混合，并用酸度計(jì)調(diào)節(jié)其pH值分別為2.32、2.61、3.39、4.63、5.39、6.52、7.31、8.60、9.43、10.69、11.61和12.71。

1.3 測定條件的優(yōu)化

于4 mL比色管中加入50 μL 2.5×10-4mol/L紅景天苷溶液，然后用緩沖溶液(pH 7.31)配制成2.5 mL溶液，藥物的濃度為5 μmol/L，平行配制5份，考查時(shí)間、酸度、激發(fā)光和溫度對體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、10、20、40、60、80、100 μg/mL，在310 nm處測定紅景天苷熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)，以紅景天苷濃度c為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.5 共存物質(zhì)的影響

在濃度為2 μmol/L的紅景天苷溶液中加入4種常見金屬離子Cu2+、Mg2+、Al3+和Fe3+，考查共存離子對熒光強(qiáng)度的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，以被測物的最大紫外吸收波長作為激發(fā)波長測量熒光發(fā)射光譜，確定最佳發(fā)射波長；在選定的最佳發(fā)射波長下，改變激發(fā)波長，測量熒光激發(fā)光譜，確定最佳激發(fā)波長。

濃度為5 μmol/L的紅景天苷溶液的熒光光譜如圖2所示。激發(fā)波長為275 nm，發(fā)射光譜在280～500 nm范圍內(nèi)，發(fā)射峰波長在310 nm處。

圖2 紅景天苷的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

2.2 熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化

將新配制的濃度為5 μmol/L的紅景天苷溶液在48 h內(nèi)進(jìn)行連續(xù)測量，間隔一定時(shí)間記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果列于表1。從表1中看出紅景天苷的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，在48 h內(nèi)變化很小。

表1 放置時(shí)間對紅景天苷熒光強(qiáng)度的影響

2.3 溫度的影響

溫度對于溶液的熒光強(qiáng)度有著一定的影響，在溶液溫度下降的過程中，介質(zhì)的黏度逐漸增大，熒光物質(zhì)分子與溶劑分子的碰撞也隨之減少，這會給熒光效率造成一定的影響；而溶液溫度上升過程中，一方面分子內(nèi)部能量發(fā)生轉(zhuǎn)換作用，另一方面激發(fā)分子可能與溶劑分子發(fā)生某些可逆的光化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。

考察濃度為10 μmol/L紅景天苷溶液在20～60℃范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，隨溫度的升高熒光強(qiáng)度降低，紅景天苷在溫度為60℃時(shí)的熒光強(qiáng)度幾乎是常溫條件下的一半。在20℃時(shí)，熒光值較大且比較穩(wěn)定，是測定的合適溫度，因此本實(shí)驗(yàn)選在常溫條件下測定。

表2 溫度對紅景天苷熒光強(qiáng)度的影響

2.4 酸度的影響

室溫條件下，固定紅景天苷濃度為5 μmol/L，在不同酸度范圍內(nèi)測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨pH值的增加熒光強(qiáng)度逐漸降低，在pH<7時(shí)，降低不明顯；當(dāng)pH>7時(shí)，熒光強(qiáng)度隨pH值的增加而明顯降低；當(dāng)pH>11時(shí)，熒光強(qiáng)度幾乎觀察不到。實(shí)驗(yàn)最終確定在溶液酸度為pH 7的條件下進(jìn)行測定。

圖3 溶液酸度對紅景天苷熒光強(qiáng)度的影響

2.5 乙醇濃度的影響

考查了乙醇濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響，見圖4。由圖4可知，隨乙醇含量增加紅景天苷熒光強(qiáng)度隨之增大，當(dāng)乙醇含量大于50%時(shí)，紅景天苷熒光強(qiáng)度幾乎不再隨乙醇含量的增加而增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度對藥物熒光值影響較大。由于乙醇溶劑易揮發(fā)，且乙醇對熒光增強(qiáng)的影響不是很大，因此實(shí)驗(yàn)選擇在水溶液中進(jìn)行測定。

圖4 乙醇對紅景天苷熒光強(qiáng)度的影響

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

紅景天苷濃度在0.04～18.03 μg/mL的范圍內(nèi)，線性回歸方程為F=19.22c+3.365，r=0.999 6，回歸曲線見圖5。光學(xué)分析法的檢出限按DL=3s/k計(jì)算，其中s為空白溶液信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為靈敏度(即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。經(jīng)計(jì)算紅景天苷的檢出限為0.019 μg/mL。

圖5 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)取樣5次進(jìn)行測定，其熒光強(qiáng)度為319.06、316.59、318.95、317.88、317.53，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33%(n=5),表明方法的精密度良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

濃度為6.01 μg/mL紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液其理論熒光值為118.09，實(shí)際測得值為122.81，其相對誤差為4.0%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.9 共存物的影響

血漿中存在多種金屬離子，雖然濃度較低，但是卻起著非常重要的生理作用。在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，研究了4種常見金屬離子對紅景天苷測定結(jié)果的影響。研究了紅景天苷濃度為2 μmol/L、測定的相對誤差在±5%之內(nèi)時(shí)，共存離子的最大允許濃度，結(jié)果見表3。

表3 共存物的影響(n=5)

3 結(jié)論

建立了測定紅景天苷的熒光光譜方法?？疾炝巳軇O性、放置時(shí)間、溶液pH值和共存離子對紅景天苷熒光強(qiáng)度測定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光光譜法具有儀器設(shè)備簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該法的建立為紅景天苷含量測定提供了一種新的方法。

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