李佩珊，張春燕，李時(shí)君，陳妍，項(xiàng)美娟，李方和，張洪

(1.武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院藥劑科，430060;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心，武漢 430030)

莢膜多糖是細(xì)菌類疫苗(如腦炎球菌疫苗等)制備的重要物質(zhì)之一，其抗體，尤其是單克隆抗體的研制是推動(dòng)產(chǎn)品(診斷、分型及其抗體治療產(chǎn)品)質(zhì)量評(píng)價(jià)及其疫苗接種效果監(jiān)測(cè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［1-2］。由于分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且抗原性弱，此類多糖疫苗對(duì)相應(yīng)疾病預(yù)防的效果欠佳，對(duì)應(yīng)抗體尤其是單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的制備亦因而受到較大的影響［3-4］。鑒于與載體(蛋白)的耦聯(lián)能顯著提升此類物質(zhì)的免疫特性［5］，筆者所在單位曾進(jìn)行A群奈瑟腦膜炎球菌莢膜多糖(Neisseria meningococcal serogroup A polysaccharide，GAMP)-破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid，TT)耦聯(lián)物制備的研究。為方便對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制與生產(chǎn)監(jiān)測(cè)，筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了抗GAMP單克隆抗體(抗GAMP mAb)制備，并對(duì)其相關(guān)特征進(jìn)行了考核，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Sp2/0細(xì)胞由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供;RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑等購(gòu)自Gibco公司;聚乙二醇4000，次黃嘌呤(hypoxathine，H)、氨蝶呤(aminopterin，A)、胸苷(thymidine，T)、小鼠免疫球蛋白亞類檢測(cè)試劑、羊抗鼠IgG(GAM)及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗鼠 IgG(GAM-HRP)，以及HRP等購(gòu)自Sigma公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;染色體分析試劑(秋水仙素等)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);純化GAMP抗原、TT、GAMPTT、基因重組乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)以及氫氧化鋁［Al(OH)3］凝膠與BALB/c小鼠等由武漢生物制品研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物免疫 取 GAMP及 GAMP-TT各適量(50 μg·mL-1)，加等體積弗氏完全佐劑混合，乳化后分別于實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(每組15只，雌性，6～8周齡)BALB/c小鼠背部皮下作多點(diǎn)注射，每只小鼠每次注射 0.2 mL(5.0 μg)。2 周后取同上抗原，加等體積弗氏不完全佐劑乳化，背部皮下多點(diǎn)注射;間隔2周同上法做加強(qiáng)免疫共3次。于各次免疫后10 d采血，分離血清置－20℃凍存。

另取BALB/c小鼠1只，同上法以GAMP-TT結(jié)合物進(jìn)行免疫，末次加強(qiáng)免疫改為以相同劑量抗原做腹腔注射，3 d后摘取脾臟做細(xì)胞融合。

1.2.2 雜交瘤細(xì)胞建株 采用常規(guī)聚乙二醇法融合，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。

1.2.3 單克隆抗體的篩選 抗GAMP mAb的篩選與效價(jià)檢測(cè)采用間接酶聯(lián)免疫吸附法。主要實(shí)驗(yàn)步驟為采用GAMP(融合篩選)或GAMP-TT(克隆化篩選與效價(jià)滴定)包被酶標(biāo)反應(yīng)板(4℃放置過(guò)夜)，加入被篩選培養(yǎng)上清液反應(yīng)(室溫放置30 min)并洗滌，加入酶標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)(室溫放置30 min)并洗滌，以及加入HRP底物系統(tǒng)顯色及其結(jié)果判讀等。具體操作參照文獻(xiàn)及本室常規(guī)［6］。

1.2.4 抗GAMP mAb的制備 抗GAMP mAb雜交瘤腹腔積液的制備采用降植烷誘導(dǎo)法;純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法;腹腔積液及純化產(chǎn)物蛋白含量檢測(cè)采用紫外比色法;產(chǎn)物純度的鑒定采用Western blot;純化產(chǎn)物的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記采用改良過(guò)碘酸鹽氧化法。上述實(shí)驗(yàn)的具體操作按本室常規(guī)并參考相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2.5 雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定 加入秋水仙素作阻斷培養(yǎng)，以低滲法處理后制備標(biāo)本滴片，染色，計(jì)數(shù)約50個(gè)染色體分布均勻而完整的雜交瘤細(xì)胞，并計(jì)算其染色體數(shù)目均值。

1.2.6 抗GAMP mAb的特異性鑒定 抗原替代實(shí)驗(yàn)與抗原中和實(shí)驗(yàn)參照既往文獻(xiàn)報(bào)道［7］。具體操作如下，抗原替代實(shí)驗(yàn):①以抗GAMP 2E7 mAb包被酶標(biāo)反應(yīng)板;②將GAMP及其他幾種不同替代抗原稀釋至5.0 μg·mL-1，加至各包被板各相應(yīng)反應(yīng)孔中，每一抗原加5孔，室溫反應(yīng)45 min，常規(guī)洗滌5次;③加入適宜濃度的抗GAMP mAb-HRP，室溫反應(yīng)45 min，常規(guī)洗滌5次;④按常規(guī)完成剩余酶聯(lián)免疫吸附法操作?？乖泻蛯?shí)驗(yàn):①以GAMP-TT包被酶標(biāo)反應(yīng)板;②根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將抗GAMP mAb-HRP稀釋成2倍最適酶聯(lián)免疫吸附濃度;③將幾種不同中和抗原調(diào)整至相同的基礎(chǔ)濃度(2.0 mg·mL-1)，并按表3做系列稀釋;④在各抗原稀釋孔中分別加入等體積抗GAMP mAb-HRP，置室溫30 min;⑤將中和反應(yīng)后的標(biāo)本加入各相應(yīng)的包被孔中;按常規(guī)完成剩余酶聯(lián)免疫吸附法操作。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫原的評(píng)價(jià)與選擇 采用GAMP-TT與GAMP對(duì)兩組BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，以間接ELISA(GAMP包被)對(duì)其抗GAMP進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩者免疫效果(幾何平均效價(jià))進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1結(jié)果，選擇GAMP-TT作抗原，同法免疫用以制備抗GAMP mAb。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

2.2.1 融合與雜交瘤細(xì)胞篩選 采用常規(guī)聚乙二醇法融合，間接酶聯(lián)免疫吸附法作抗GAMP mAb篩選，經(jīng)3次克隆化后獲得1株分泌抗GAMP mAb的雜交瘤細(xì)胞(2E7)。不同時(shí)段該雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與分泌狀況見(jiàn)表2。

2.2.2 腹腔積液制備及檢測(cè) 將雜交瘤細(xì)胞調(diào)整至1×107·mL-1，將其注射到5只預(yù)先用降植烷處理過(guò)的BALB/c小鼠腹腔中，于接種后11～14 d分別采取腹腔積液，1500 r·min-1(r=17.9 cm)離心 10 min，取中層液體混合后分裝，置－20℃凍存。5只小鼠腹腔積液采集量3.7～8.1 mL(平均5.42 mL);混合抗體腹腔積液總蛋白23.50 g·L-1;混合腹腔積液抗GAMP效價(jià)為1×10-8(間接酶聯(lián)免疫吸附法)。

表1 2種不同抗原對(duì)BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

表1 2種不同抗原對(duì)BALB/c小鼠的免疫效果Tab.1 Results of BALB/c mice immunized with two different antigens

與對(duì)照組比較，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＞0.05，*2P ＜0.01

表2 抗GAMP 2E7雜交瘤細(xì)胞的融合、克隆化及篩選Tab.2 Results of fusing，cloning and screening of anti-GAMP 2E7 hybridoma cells

2.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體鑒定 采用秋水仙素阻斷法對(duì)經(jīng)3次克隆化后的2E7雜交瘤細(xì)胞做染色體計(jì)數(shù)檢測(cè)，染色結(jié)果見(jiàn)圖1。隨機(jī)選取45個(gè)溶脹充分、染色體分布均勻的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，染色體數(shù)量在137～145 條之間，平均染色體數(shù)(139.73 ±2.16)條。

圖1 抗GAMP mAb分泌2E7雜交瘤細(xì)胞的染色體檢測(cè)Fig.1 Chromatic picture of 2E7 hybridoma cell that secreted anti-GAMP mAb

2.4 單抗的純化與鑒定

2.4.1 單克隆抗體的純化 取上述2E7雜交瘤細(xì)胞誘生的小鼠腹腔積液3.0 mL，以辛酸-硫酸銨沉淀法純化;紫外比色法［以牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為參比］測(cè)定其純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的含量。前后兩次提取物 IgG濃度分別為1.76和2.32 mg·mL-1。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，抗 GAMP 效價(jià)分別為2.56 ×106及5.12 ×106。

2.4.2 純化產(chǎn)物的標(biāo)記 采用改良過(guò)碘酸鹽法對(duì)2E7 mAb提取產(chǎn)物做HRP標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)鹽析并透析后加甘油至40%，置－20℃凍存。采用直接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定，其標(biāo)記產(chǎn)物效價(jià)為1/25600 。

取上述標(biāo)記產(chǎn)物(抗GAMP mAb HRP)適量，采用40% 丙三醇將其稀釋至效價(jià)為1/200，適量分裝置－20℃凍存，臨用時(shí)稀釋。

2.4.3 產(chǎn)物純度鑒定 采用SDS-PAGE對(duì)提取物進(jìn)行進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，提取物經(jīng)SDS PAGE后顯示兩條染色區(qū)帶，其相對(duì)分子質(zhì)量分別約為75000 及45000 ，灰度掃描分析顯示其純度為97.6%。

圖2 純化抗GAMP E7 mAb純度的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purity of anti-GAMP E7 mAb

2.4.4 抗GAMP 2E7 mAb的Ig亞類鑒定 采用膠體金免疫層析實(shí)驗(yàn)對(duì)抗GAMP 2E7培養(yǎng)上清液中Ig的類型與亞類進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體屬IgG，其亞類為IgG1。

2.4.5 抗GAMP 2E7 mAb的特異性考核

2.4.5.1 抗原中和實(shí)驗(yàn) 采用前述方法做抗原替代實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3［以中和孔吸光度值(A)/中和率(%)表示］。兩種A群流腦菌多糖中和孔當(dāng)抗原濃度在0.10 μg·mL-1時(shí)出現(xiàn)明顯中和效果(中和率 ＞50.0%)，抗原濃度在10.00 μg·mL-1時(shí)基本達(dá)到完全中和。其余抗原替代孔中和反應(yīng)呈陰性。

2.4.6 抗原替代實(shí)驗(yàn) 采用前述方法做抗原替代實(shí)驗(yàn)，分別采用 GAMP-TT、GAMP、TT、HBsAg、BSA 包被，各反應(yīng)孔顯色強(qiáng)度(A450)分別為2.67 ±0.065，2.04 ±0.132，0.045 ±0.043，0.032 ± 0.029，0.029 ± 0.031?？梢?jiàn)，采用GAMP與GAMP-TT進(jìn)行包被，各反應(yīng)孔均呈陽(yáng)性顯色反應(yīng)，但其顯色強(qiáng)度(A450)以采用GAMPTT者為高，顯色的可重復(fù)性亦明顯高于采用GAMP包被孔。單純TT包被及采用無(wú)關(guān)抗原包被組各反應(yīng)孔未顯示明確的陽(yáng)性信號(hào)，其顯示強(qiáng)度分別與GAMP及GAMP-TT兩組相比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 抗GAMP 2E7 mAb特異性考核抗原中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of specificity identification using neutralization assay that conjugated anti-GAMP 2E7 mAb

3 討論

與普通多態(tài)性抗原相比，純化后的細(xì)菌莢膜多糖在抗原性上存在較多缺陷［1-2］，通過(guò)與適當(dāng)載體的結(jié)合，其免疫特征能得到極大改善［3-4］。這一現(xiàn)象作為疫苗制劑學(xué)中的一項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)，已被用于多種細(xì)菌多糖疫苗的制備，將其用于A群流腦菌多糖結(jié)合疫苗、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗等疫苗的研制及其臨床應(yīng)用，取得理想的預(yù)防效果［1-2］。采用結(jié)合多糖(如GAMP-TT)包被酶標(biāo)反應(yīng)板，所制備試劑對(duì)相應(yīng)抗體檢測(cè)的穩(wěn)定性大幅提高［8］。鑒于相應(yīng)抗體(尤其是單克隆抗體)的制備與研究同樣受多糖自身免疫缺陷的制約［4］，筆者以抗GAMP mAb的研制為契機(jī)，對(duì)載體結(jié)合多糖在單克隆抗體制備中的應(yīng)用特征進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下采用GAMP與GAMP-TT對(duì)一組BALB/c小鼠做對(duì)比免疫，后者的免疫效果較前者升高超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)，為采用結(jié)合多糖做免疫原制備單克隆抗體提供了選擇依據(jù)。采用GAMP-TT免疫BALB/c小鼠，經(jīng)常規(guī)融合及篩選，獲得一株分泌抗GAMP mAb的雜交瘤細(xì)胞(2E7)。采用既往報(bào)道的方法制備小鼠腹腔積液，純化mAb IgG，并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記(HRP)，其腹腔積液誘生產(chǎn)量、提取物純度以及標(biāo)記抗體的效價(jià)等與既往單克隆抗體研究結(jié)果大致相同。采用中和及抗原取代酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)上述制備物進(jìn)行考核，初步證實(shí)2E7 mAb對(duì)GAMP的結(jié)合具有良好的特異性。

單克隆抗體技術(shù)發(fā)端于20世紀(jì)70年代中期，其應(yīng)用已十分普及。然而作為一種大分子弱抗原，細(xì)菌莢膜多糖mAb的制備往往需要借助某些新的實(shí)驗(yàn)手段［4，8］。采用多糖-蛋白耦聯(lián)物以矯正并提高多糖的免疫原性是新近研究者所熱衷的主要手段之一。然而影響多糖-蛋白偶聯(lián)物免疫原性的因素至少包括多糖分子大小，載體蛋白的種類，多糖、蛋白耦聯(lián)度，耦聯(lián)劑(或稱間隔基)的種類，耦聯(lián)方法及其耦聯(lián)條件的優(yōu)化等［4］。筆者采用GAMP-TT耦聯(lián)物進(jìn)行免疫，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫狀態(tài)較佳，并獲得一株具有較好分泌特征的mAb細(xì)胞株。但該細(xì)胞株在融合及其早期克隆化過(guò)程中的狀態(tài)并不盡如人意，染色體檢測(cè)表現(xiàn)出明確的多細(xì)胞融合證據(jù)。盡管經(jīng)反復(fù)的克隆化與適應(yīng)性培養(yǎng)而獲得了具有穩(wěn)定增殖與分泌特征的雜交瘤細(xì)胞株［9］，但這一現(xiàn)象是否多見(jiàn)于此類特殊制備，即采用結(jié)合多糖免疫制備單克隆抗體的方法仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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