王盛蘭,陳 玲,張建勇,宗兆靖,王寶林,李娜娜,王建華,張 泓

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Microbacterium Tuberculosis,M.tb)引起的慢性傳染病。20世紀(jì)90年代至今,由于耐藥結(jié)核病,特別是耐多藥與廣泛耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)和流行,使得結(jié)核病死灰復(fù)燃,成為全球結(jié)核病疫情第三次回升的主要原因之一。耐多藥結(jié)核病(Multidrug-Resistant Tuberculosis,MDR-TB)是指結(jié)核分枝桿菌至少對(duì)異煙肼和利福平兩種抗結(jié)核藥物同時(shí)耐藥。中國(guó)是世界上耐藥結(jié)核病疫情最嚴(yán)重的國(guó)家,排名第一,全球1/4的MDR-TB患者在中國(guó)。MDR-TB的蔓延給本就不容樂(lè)觀的結(jié)核病疫情雪上加霜。然而,耐藥結(jié)核病給人類造成的巨大危害并未就此停步,結(jié)核分枝桿菌的耐藥程度日益加重。2006年,在南非爆發(fā)流行廣泛耐藥結(jié)核病(Extensively Drug-Resistant Tuberculosis,XDR-TB),55例 XDR-TB中44例合并HIV感染,其中54例死亡,中位生存期僅16d[1]。XDR-TB即結(jié)核分枝桿菌在耐多藥基礎(chǔ)上對(duì)任何一種氟喹諾酮類藥物以及三種注射藥物(硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中至少一種耐藥,其治療極為困難,幾乎無(wú)藥可用,已成為社會(huì)公共衛(wèi)生面臨的最大挑戰(zhàn)。全球5.4%的 MDR-TB為 XDRTB,每年新感染2.5萬(wàn) XDR-TB患者[2]。2007至2008年全國(guó)結(jié)核病耐藥基線調(diào)查結(jié)果顯示:新感染和復(fù)治肺結(jié)核病人中MDR-TB的比例分別為5.7%和25.6%,XDR-TB為0.68%,每年新發(fā)MDR-TB病例約10萬(wàn),XDR-TB約1萬(wàn)。2008年,北京胸科醫(yī)院首次發(fā)表了中國(guó)XDR-TB的相關(guān)文獻(xiàn),其運(yùn)用數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列和結(jié)核分枝桿菌散在分布重復(fù)單位(VNTR-MIRU)對(duì)廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的遺傳背景進(jìn)行了分析[3]。但 XDR-TB耐藥的分子機(jī)制目前尚未明確,與XDR-TB耐藥有關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因信息也未見報(bào)道。

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)研究在特定時(shí)間或環(huán)境下某種細(xì)胞或組織基因組的全部蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異,是發(fā)現(xiàn)和鑒定細(xì)菌特異性蛋白的常用手段。雙向電泳(Two-Dimensional Gel Electrophoresis,2-DE)和質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的兩大核心技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)對(duì)細(xì)菌蛋白的全局變化進(jìn)行分析,有助于細(xì)菌耐藥分子機(jī)制的闡明?；谀退幗Y(jié)核的嚴(yán)峻形勢(shì)和蛋白質(zhì)組學(xué)所具有的優(yōu)勢(shì),本研究應(yīng)用2-DE和MS技術(shù),首次對(duì)廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化進(jìn)行了研究,分析了廣泛耐藥與耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異(新增、缺失,上調(diào)和下調(diào)),以進(jìn)一步尋找與XDR-TB耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì),為結(jié)核分枝桿菌廣泛耐藥機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 廣泛耐藥與耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株來(lái)源于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科痰抗酸桿菌涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者痰標(biāo)本(診斷符合《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)900804),進(jìn)行抗酸桿菌培養(yǎng)、菌型鑒定及藥物敏感試驗(yàn)(按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行)。廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平、鏈霉素、左氧氟沙星和卷曲霉素耐藥;耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素4種一線抗結(jié)核藥物耐藥,標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 預(yù)制IPG膠條(17cm,p H4-7,Bio-Rad公司)、IEF Buffer(p H4-7,Bio-Rad公司),丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、硫脲、SDS、DTT、碘帶乙酰胺、Tris堿、CHAPS、甘氨酸、礦物油、考馬斯亮蘭均為進(jìn)口或進(jìn)口分裝試劑,過(guò)硫酸胺、硝酸銀、溴酚蘭為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 固相p H梯度等電聚焦儀PROTEAN IEF Cell(美國(guó)Bio-Rad公司),PROTEAN II xi Cell垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司),ImageS-canner 2D圖像掃描系統(tǒng)(Amersham公司),紫外分光光度儀 (日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品的制備 用接種環(huán)在改良羅氏培養(yǎng)基斜面上環(huán)刮取5～6環(huán)結(jié)核分枝桿菌菌落,置于4mL純水中,80℃水浴30min滅活,4 000 g,10min離心,棄上清,加入3mL PBS溶液洗滌5次。加裂解液0.3mL,酶抑制劑10μL,冰浴20min,超聲破碎裂解細(xì)菌(功率為200W,每次超聲處理1min,共30次),超聲處理后的樣品于 40 000g,4℃,30min,冰凍離心,取上清,加入4倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀蛋白質(zhì),-20℃過(guò)夜,10 000g離心5min,棄去上清,待丙酮揮發(fā)后,加入7mol/L尿素2mol/L硫脲溶液復(fù)溶蛋白質(zhì),待蛋白質(zhì)充分溶解后,40 000g,4℃離心30min,取1mL上清進(jìn)行熒光法蛋白定量,-20℃保存上清液。

1.2.2 第一向等電聚焦電泳 上樣量為200mg,將120mL蛋白質(zhì)樣品與480mL水化上樣緩沖液混合,加入樣品水化盤中,放入預(yù)制膠條(17cm,p H 4-7),加蓋3mL礦物油。設(shè)置并啟動(dòng)等電聚焦電泳程序,選用梯度升壓法(0V 1h,50V 10h快速升壓,500V 1.5h線性升壓,2000V 1.5h線性升壓,5000V 1.5h線性升壓,8000V 1.5h線性升壓,8000V 70000VH快速升壓,500V 16h快速升壓)。

1.2.3 第二向SDS-PAGE電泳 等電聚焦電泳結(jié)束后的膠條先用6mL膠條平衡緩沖液I(6 mol/L尿素,2%SDS,0.375mol/L p H 8.8 Tris-HCl,20%甘油,2%DTT)平衡14 min,再用6mL膠條平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L尿素,2%SDS,0.375 mol/L p H 8.8 Tris-HCl,20%甘油,2.5%碘乙酰胺)平衡14min。平衡后的膠條置于預(yù)先制備好的13%聚丙烯酰胺凝膠的頂端,加入融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液,先以每根膠條20mA的電流電泳至樣品完全走出膠條,然后以每根膠條60 mA的電流電泳6h,至溴芬蘭距底部1 cm處結(jié)束。電泳完畢后凝膠進(jìn)行高靈敏度銀染、考馬斯亮籃染色 ,脫色過(guò)夜。掃描膠圖采集圖像。

1.2.4 凝膠圖像分析 凝膠圖像掃描儀掃描凝膠。比較多次實(shí)驗(yàn)后電泳質(zhì)量和重復(fù)性,選取效果最好的凝膠圖像通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件(Progenesis SameSpots,英國(guó)Nonlinear Dynamics公司)進(jìn)行對(duì)比分析。選取結(jié)核分枝桿菌藥物敏感株(H37Rv)的蛋白質(zhì)凝膠圖為標(biāo)準(zhǔn),將 XDR-TB和MDR-TB的蛋白質(zhì)凝膠圖與其配比,篩選出XDR-TB較其它兩者有差異的蛋白點(diǎn)(新增、缺失、上調(diào)和下調(diào))。

1.2.5 肽質(zhì)量指紋圖譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索根據(jù)凝膠圖像分析結(jié)果,選取差異明顯的蛋白點(diǎn),送北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

2 結(jié) 果

2.1雙向電泳圖蛋白點(diǎn)分布 運(yùn)用 Progenesis SameSpots軟件對(duì)比分析 XDR-TB、MDR-TB和H37Rv敏感菌株雙向電泳圖譜表明,3者膠圖總體模式一致,但XDR-TB與其它兩株比較有明顯差異。3株結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白分子量均處于10～97 kDa,等電點(diǎn)(PI)主要分布于4～7(圖1)。XDRTB與MDR-TB兩耐藥標(biāo)本蛋白PI值主要分布于4.5到6.0,而 H37Rv敏感菌株的菌體蛋白PI值主要分布于4.5到7.0,在p H 5.5到7.0區(qū)域兩耐藥標(biāo)本與敏感菌株蛋白點(diǎn)數(shù)量差異較大,耐藥標(biāo)本偏堿性蛋白較少,敏感菌株則較多(圖1)。廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌雙向凝膠電泳圖蛋白點(diǎn)分布較H37Rv和耐多藥結(jié)核分枝桿菌具有明顯差異。

圖1 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv(A)、耐多藥株(MDR)(B)和廣泛耐藥株(XDR)(C)蛋白2-DE截圖比較Fig.1 Screenshots of 2-DE image comparison of H37Rv,MDRand XDRMycobacterium tuberculosis

2.2 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)分析 H37Rv、MDR和XDR結(jié)核分枝桿菌膠圖對(duì)比顯示77個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(表達(dá)量差別2倍以上為有差異,5倍以上為差異明顯),其中28個(gè)與 XDR結(jié)核分枝桿菌密切相關(guān)。XDR結(jié)核分枝桿菌新增蛋白質(zhì)點(diǎn)10個(gè)(表1),缺失蛋白點(diǎn)3個(gè)(表2),上調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)2個(gè)(表3)下調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)13個(gè)(表4)。

2.3 質(zhì)譜鑒定及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 質(zhì)譜鑒定蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋譜,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,結(jié)合雙向凝膠電泳圖上相應(yīng)蛋白點(diǎn)的分子量及pI值 ,得到15個(gè)XDR-TB差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的相關(guān)資料(表5,表6),其中5個(gè)蛋白點(diǎn)匹配上明確的蛋白質(zhì),并獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息(表6)。

3 討 論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù),分析了結(jié)核分枝桿菌耐多藥、單耐藥和 H37Rv菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)[4-6],但目前尚未見廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)報(bào)道。本研究采用較考馬斯亮藍(lán)染色敏感性更高的銀染技術(shù),第一次在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上對(duì)XDR結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了研究。對(duì)比XDR與MDR結(jié)核分枝桿菌及 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株菌體蛋白2-DE圖譜,顯示各標(biāo)本蛋白分子量分布在10～97 kDa,等電點(diǎn)(PI)值主要分布于4～7之間(圖1),與文獻(xiàn)報(bào)道相似[4-6],但 XDR與 MDR結(jié)核分枝桿菌在偏堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)較標(biāo)準(zhǔn)株減少,提示結(jié)核分枝桿菌偏堿性蛋白表達(dá)下降可能與其耐藥有一定相關(guān)性。另有研究顯示單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌在偏堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)較H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株增多[5],說(shuō)明單耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌與XDR/MDR結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白表達(dá)有差異。XDR結(jié)核分枝桿菌雙向凝膠電泳圖蛋白點(diǎn)總體分布較 MDR及H37Rv有明顯差異,說(shuō)明XDR結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的菌體蛋白譜與MDR及 H37Rv結(jié)核分枝桿菌菌體蛋白譜有所不同。本實(shí)驗(yàn)篩選出77個(gè)在XDR、MDR及H37Rv結(jié)核分枝桿菌中差異表達(dá)的蛋白點(diǎn),其中28個(gè)蛋白點(diǎn)在XDR結(jié)核分枝桿菌中表達(dá)有明顯的差異,包括10個(gè)新增和2個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn),提示與結(jié)核分枝桿菌廣泛耐藥有一定關(guān)系;3個(gè)缺失和13個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),提示與結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性相關(guān)。

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質(zhì)譜測(cè)序分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢配比成功的5個(gè)蛋白中,19kD主要膜蛋白屬于結(jié)核分枝桿菌主要膜蛋白家族,是重要的結(jié)構(gòu)蛋白,在毒力較強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌Erdman株表達(dá)豐富[20],19kD主要膜蛋白在XDR結(jié)核分枝桿菌的作用還需進(jìn)一步研究。核糖體蛋白除參與核糖體的構(gòu)成,影響蛋白質(zhì)的生物合成外,其中一些還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、分化等核糖體外作用。核糖體蛋白S3(ribosomal protein S3,RPS3)是組成核糖體的40S亞單位,廣泛存在于真核生物,在哺乳動(dòng)物和果蠅中具有DNA修復(fù)酶的核糖體外功能[21]。在白血病藥物敏感細(xì)胞株K562轉(zhuǎn)染RPS3真核表達(dá)質(zhì)粒后,對(duì)阿霉素的耐藥性增強(qiáng);在mRNA水平阻斷 RPS3基因表達(dá)后,耐藥細(xì)胞 K562/DOX對(duì)阿霉素敏感性增強(qiáng)[22],提示RPS3與耐藥有一定關(guān)系,但在 XDR/MDR結(jié)核分枝桿菌中的作用有待進(jìn)一步研究。

本研究首次對(duì)比了廣泛耐藥、耐多藥以及標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌株菌體蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)了廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)具有特異性,并挑選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),為進(jìn)一步了解結(jié)核分枝桿菌廣泛耐藥的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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