陳崢宏,劉 峰,包懷恩,吳曉娟,楊婷秀

2.貴州省人民醫(yī)院,貴陽(yáng) 550004

豬囊蟲(chóng)病是由于家豬食入鏈狀帶絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵,蟲(chóng)卵中幼蟲(chóng)在消化液作用下逸出,移行并在皮下、肌肉和腦組織等組織器官內(nèi)發(fā)育為囊尾蚴而引起,人也可因食入蟲(chóng)卵而發(fā)生囊蟲(chóng)病。囊蟲(chóng)病呈世界性分布,我國(guó)的流行和分布也相當(dāng)廣泛,遍及全國(guó)。雖然豬囊尾蚴可寄生在中間宿主的肌肉、皮下、腦、眼等組織和器官,也包括肝臟[1-2],但往往只有臨床表現(xiàn)明顯的腦型、眼型和嚴(yán)重的皮肌型囊尾蚴病由于癲癇發(fā)作、視力障礙或皮下可見(jiàn)明顯結(jié)節(jié)或包塊才會(huì)引起人們的重視,肝囊蟲(chóng)病由于缺乏特異的臨床表現(xiàn)使豬囊尾蚴在人肝臟的寄生和對(duì)健康的危害尚未引起人們的關(guān)注。本文以鏈狀帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染獼猴,觀察獼猴肝功能、肝臟聲像圖特征及病理變化特征,并對(duì)獼猴進(jìn)行血清豬囊尾蚴抗體檢查,為人肝囊尾蚴病的危害評(píng)估和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 鏈狀帶絳蟲(chóng)采自云南省大理白族自治州鳳儀鎮(zhèn)的近期有排絳蟲(chóng)節(jié)片史病人,以檳榔-南瓜子法驅(qū)蟲(chóng),蟲(chóng)體用自來(lái)水、0.85%生理鹽水漂洗后保存于滅菌的25%甘油水溶液運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒別鑒定為鏈狀帶絳蟲(chóng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)用獼猴,雌性,體重為5.9 kg,重慶碩斯靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究有限公司提供,合格證號(hào)：SCXR(渝)2008-0001。

1.3 主要試劑 肝功能檢測(cè)試劑均為澳斯邦原裝試劑;透明質(zhì)酸放射免疫分析藥盒,購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所;考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗猴IgG,TMB顯色試劑盒,購(gòu)自北京博奧森生物科技公司;安定,貴州光定制藥,批號(hào) 090817;氯胺酮,江蘇恒瑞制藥,批號(hào)071005。

1.4 獼猴的感染和B超檢查 獼猴感染前抽取早晨空腹靜脈血分離血清凍存于-20℃?zhèn)溆?經(jīng)肌肉注射安定(0.2～0.3mg/kg)鎮(zhèn)靜和鹽酸氯胺酮麻醉后(5mg/kg)以PHILIPS IU22型彩色超聲儀,探頭頻率2.5～10.0 MHz,進(jìn)行肝臟彩超檢查。分別將5×105個(gè)鏈狀帶絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵加入飼料內(nèi)喂食獼猴,專用飼料飼養(yǎng),并每日喂食適量新鮮水果。感染第84 d,抽取空腹靜脈血分離血清備用,麻醉后以同一臺(tái)超聲儀和同樣的探頭頻率進(jìn)行肝臟B超檢查,記錄病灶數(shù)目、大小、形態(tài)、內(nèi)部及后方回聲特征,將病變區(qū)圖像局部放大,彩色多普勒血流速度量程調(diào)至低速血流狀態(tài)(3～6cm/s),觀察局部血流,并根據(jù)聲像圖特征提示超聲診斷。

1.5 獼猴感染前后部分肝功能指標(biāo)的檢查 將感染前后的獼猴血清以拜耳1650全自動(dòng)生化分析儀采用澳斯邦原裝試劑進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)和總膽汁酸鹽(TBA)的檢測(cè);透明質(zhì)酸(HA)檢測(cè)采用固相放射免疫法按藥盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 獼猴的剖檢、囊尾蚴的分布及肝病變組織的病原核酸檢測(cè)和病理學(xué)檢查 于感染第90d以肌肉注射安定(1 mg/kg)和氯胺酮(20mg/kg)麻醉獼猴致死,測(cè)量體重,剖檢全身各組織器官,采集囊尾蚴,并立即置于0.5%(mL/mL)膽汁鹽水中,于室溫下孵育至頭節(jié)翻出,將翻出頭節(jié)的囊尾蚴放置于一滴生理鹽水中,于載玻片上直接用光學(xué)顯微鏡觀察后加覆蓋玻片制片鏡檢。仔細(xì)檢查獼猴肝組織,取病變組織經(jīng)10%甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片、HE染色鏡檢。

1.7 獼猴血清中豬囊尾蚴抗體的檢查

1.7.1 豬囊尾蚴抗原的制備 將豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵實(shí)驗(yàn)感染的家豬肌肉內(nèi)檢獲的囊尾蚴經(jīng)PBS洗滌后用玻璃勻漿器勻漿,并用超聲波粉碎儀破碎,經(jīng)臺(tái)式離心機(jī)12 000r/min離心15min,取上清濾過(guò)除菌后以考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒定量,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 血清中豬囊尾蚴抗體的ELISA法檢測(cè) 以4.9μ g/mL的豬囊尾蚴抗原包被酶標(biāo)板孔,每孔100μ L,置4℃包被過(guò)夜,洗滌液洗滌各孔,加1/10、1/100、1/200、1/400 的感染前、后獼猴血清各100μ l,每份稀釋血清重復(fù)3孔,同時(shí)設(shè)置 3孔 PBS對(duì)照。經(jīng)37℃孵育1h,洗滌后加1/1 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗猴IgG各100μ L,37℃孵育1h,以TMB顯色試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作顯色和終止后于450nm測(cè)量各孔吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 獼猴肝臟B超檢查 感染前獼猴肝臟B超檢查未見(jiàn)異常,感染后獼猴肝臟見(jiàn)11個(gè)大小較為均一的結(jié)節(jié),形態(tài)多為類圓形、橢圓形或梭形,邊界一般較清楚,均未見(jiàn)包膜,內(nèi)部呈不均勻的低回聲或混合性回聲,多數(shù)結(jié)節(jié)壁上有強(qiáng)回聲光斑且后方伴聲影(圖1)。CDFI顯示病灶內(nèi)均無(wú)血流信號(hào),周圍可見(jiàn)正常的動(dòng)脈、肝靜脈及門(mén)靜脈樣血流信號(hào)走行。超聲診斷提示：肝臟多發(fā)實(shí)性結(jié)節(jié)伴鈣化斑。

圖1 感染鏈狀帶絳蟲(chóng)囊尾蚴84 d的獼猴肝臟超聲圖Fig.1 Liver ultrasonography of the macaque infected by T.solium larva(arrows showing nodules)

2.2 部分肝功能指標(biāo)檢測(cè) 感染前和感染第84d的獼猴空腹靜脈血中部分酶及透明質(zhì)酸的檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 感染前后獼猴的部分肝功能指標(biāo)Table 1 Indicators of liver function of the monkey before and after infection

2.3 囊尾蚴的分布及肝組織病變的病原檢查和病理學(xué)檢查 感染鏈狀帶絳蟲(chóng)囊尾蚴90天的獼猴體重為3.5kg,在獼猴肌肉內(nèi)檢獲11個(gè)囊尾蚴(圖2),心包膜下檢獲2個(gè)囊尾蚴,肝實(shí)質(zhì)內(nèi)見(jiàn)11個(gè)結(jié)節(jié),大小為(1.0×1.5)～(1.5×3)mm,其余組織器官未見(jiàn)囊尾蚴和病變。病變組織的石蠟切片HE染色鏡檢顯示,病灶內(nèi)可見(jiàn)壞死的蟲(chóng)體,周圍有纖維結(jié)締組織包裹伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以嗜酸性粒細(xì)胞為主,部分可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽腫,肉芽腫周圍纖維結(jié)締組織增生(圖3),可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性(圖4)和壞死。

圖2 獼猴肌肉內(nèi)的囊尾蚴Fig.2 Cysticerci from the monkey's muscle

2.4 血清囊尾蚴抗體的ELISA檢測(cè) 感染前、后各稀釋血清ELISA檢測(cè)的OD450見(jiàn)表2。與PBS對(duì)照相比,以大于PBS對(duì)照孔OD值2.1倍,即大于0.202為顯色陽(yáng)性,則感染后血清經(jīng)400倍稀釋,囊尾蚴抗體仍為陽(yáng)性,而感染前各稀釋血清囊尾蚴抗體均為陰性。

3 討 論

表2 獼猴感染前、后血清抗體ELISA檢測(cè)的OD450(3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均值)Table 2 OD450of the ELISAtest on the serum antibody of the monkey before and after infection(mean value of three tests)

肝寄生蟲(chóng)病在我國(guó)許多地區(qū)均有流行,多為血吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、包蟲(chóng)及蛔蟲(chóng)引起肝臟占位性病變的報(bào)道。雖然已有研究表明,除了皮膚、肌肉、眼和腦組織,家豬肝臟也是豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴的重要寄生部位[1-2],但肝囊蟲(chóng)病對(duì)人的危害尚未引起關(guān)注。本文以豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染獼猴的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,豬囊尾蚴也可寄生于獼猴的肝臟。部分肝功能相關(guān)血清酶的檢測(cè)表明,感染前后獼猴血清ALT、AST數(shù)值有所差異,但均在獼猴血清ALT、AST正常值范圍之內(nèi)[3]。人的肝血清酶學(xué)指標(biāo)中,ALT、AST等僅在急性或重型肝炎患者與健康正常人群表現(xiàn)出顯著的差異性,在慢性肝炎和酒精性肝炎則缺乏診斷價(jià)值[4]。TBA則是肝損傷的敏感指標(biāo)[5-6],它是膽固醇在肝臟中分解的代謝產(chǎn)物,其生成和代謝與肝臟密切相關(guān)。在各種肝臟疾病時(shí),肝臟對(duì)膽汁酸的重吸收減少,從而導(dǎo)致血清中 TBA的含量增加。因此測(cè)定血清中TBA可以直接反映肝臟的攝取、合成及排泄功能。在肝細(xì)胞有較輕微損傷時(shí),TBA的升高比其它常規(guī)肝功能指標(biāo)更敏感[5-6]。膽堿酯酶是肝細(xì)胞合成的水解酶,隨著肝臟纖維化程度的加重,CHE合成逐漸減少[6]。透明質(zhì)酸是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的高分子多糖,主要由肝內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行降解,慢性肝損傷時(shí),肝間質(zhì)細(xì)胞增殖,HA的合成增加;肝竇內(nèi)皮細(xì)胞受損,攝取分解HA功能降低;并且肝組織纖維化時(shí)肝內(nèi)有不同程度的血流紊亂,門(mén)靜脈分流增加,也減少了竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HA的攝取分解,導(dǎo)致血清HA升高,是反映肝纖維化的重要指標(biāo)[7]。在健康人群中,TBA值上下波動(dòng)在均值的54%以內(nèi),ChE上下波動(dòng)在均值的17%以內(nèi)[5],HA上下波動(dòng)在均值的46%以內(nèi)[7]。本實(shí)驗(yàn)中獼猴感染后與感染前相比,TBA增高3.4倍,ChE降低25%,HA增高88%。由于缺乏獼猴血清TBA、ChE和HA正常值的資料,難以根據(jù)這三項(xiàng)指標(biāo)來(lái)判斷該獼猴肝臟代償功能是否異常,然而這三項(xiàng)指標(biāo)的變化提示肝臟ChE合成、對(duì)膽汁酸重吸收的減少和對(duì)HA攝取分解能力的降低,豬囊尾蚴在獼猴肝臟的寄生已導(dǎo)致肝臟的損傷。

超聲檢查顯示獼猴肝臟病灶多為不均勻低回聲,其壁上有強(qiáng)回聲伴后方聲影,考慮為感染后組織自身修復(fù)過(guò)程中纖維組織增生,致聲阻抗差增大,從而使回聲增強(qiáng),并伴后方聲衰減。病灶內(nèi)CDFI檢查無(wú)血流信號(hào),提示肝囊蟲(chóng)病病變多為少供血的病變。本文的結(jié)果表明,超聲顯像有很高的軟組織分辨力,能靈敏地顯示出肝臟占位病變。但是,寄生蟲(chóng)感染性病灶的聲像圖特征缺乏特異性,需要進(jìn)行超聲引導(dǎo)下穿刺活檢方能鑒別良惡性病變和肝寄生蟲(chóng)感染性病變[8],若要確診為何種寄生蟲(chóng)感染,尚需結(jié)合臨床和流行病學(xué)資料以及進(jìn)行相關(guān)的病原學(xué)、免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢查。本實(shí)驗(yàn)中受染獼猴肝臟的結(jié)節(jié)周圍可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可初步診斷為寄生蟲(chóng)感染。免疫學(xué)診斷,即血清囊尾蚴IgG的ELISA檢測(cè)亦提示豬囊尾蚴的感染。

盡管肝臟具有較強(qiáng)的代償功能,但囊尾蚴的寄生和引起的炎癥反應(yīng)已經(jīng)導(dǎo)致了本實(shí)驗(yàn)中獼猴肝臟的局灶性損傷,并對(duì)肝功能造成一定的影響,其危害應(yīng)引起關(guān)注,特別是在豬帶絳蟲(chóng)和囊蟲(chóng)病流行區(qū),許多誤食豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵或感染豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的人由于未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或皮下未見(jiàn)結(jié)節(jié)而忽視了感染的存在,農(nóng)村醫(yī)療條件的限制使已經(jīng)感染了豬囊尾蚴,肝臟已出現(xiàn)病變的患者未能得到及時(shí)診斷和治療。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在豬囊蟲(chóng)病和豬帶絳蟲(chóng)病流行區(qū),血清豬囊尾蚴抗體檢測(cè)結(jié)合肝臟B超檢查,有助于發(fā)現(xiàn)肝囊蟲(chóng)病患者。

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