陳靜芳,胡旭初,王樂旬,余新炳

2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)教研室

血吸蟲病是一個重大的全球性公共健康問題,據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查統(tǒng)計,全球超過70個國家、高達(dá)2千萬人口感染血吸蟲;在中國,據(jù)統(tǒng)計2009年全國感染血吸蟲病的人數(shù)為36.6萬[1-2]。繼人類基因組計劃后,血吸蟲基因組計劃于1992年正式啟動。2003年,nature雜志同時報道了對日本血吸蟲和曼氏血吸蟲轉(zhuǎn)錄譜的初期研究結(jié)果[3-4],隨著日本血吸蟲基因組測序的完成,對其不同發(fā)育階段基因和蛋白表達(dá)動態(tài)變化的了解,將有助于探索血吸蟲生長發(fā)育機(jī)制,尋找與其生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵的酶、功能蛋白或基因,為研制有效的阻斷傳播疫苗和新藥開發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)。本研究從日本血吸蟲EST數(shù)據(jù)庫中篩選出一感興趣的基因家族——SCP/Tpx-1/Ag5/Pr-1/ScT(SCP/TAPS)蛋白家族,通過生物信息學(xué)工具對日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白家族進(jìn)行分析,并挑選出SjVAL2基因,將其構(gòu)建到pET-28a(+)原核表達(dá)載體中,對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步的研究,為進(jìn)一步闡明該基因家族的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血吸蟲成蟲、質(zhì)粒及菌株 血吸蟲成蟲由感染的兔體內(nèi)獲得,原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)和大腸桿菌BL21/DE3由本室保存。

1.1.2 主要試劑與工具酶 Ex Taq酶(含dNTP)、BamH I、XhoI、T4 DNA 連接酶 、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2,000)購自大連寶生物公司;異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)購自美國Promega公司;Ni-IDA Agarose(鎳-亞氨基二乙酸瓊脂糖)(cat No：69670)購自美國Novagen公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒純化試劑盒購自北京賽百盛基因公司;抗6×His單克隆抗體購自美國Invitrogen公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗及DAB(3,3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;PVDF膜購自Millipore公司。

1.1.3 引物合成和DNA測序 引物合成和重組質(zhì)粒DNA測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1S.japonicumSCP/TAPS基因家族的獲得和生物信息學(xué)分析 以黃蜂毒液抗原5(GenBank No.AAA30333)為檢索源,通過tBLASTn檢索日本血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫,檢索出同源的EST序列。生物信息學(xué)軟件分析各序列的結(jié)構(gòu)域,多序列同源比對和分子進(jìn)化樹分析其進(jìn)化規(guī)律,并以AAW24579蛋白為代表進(jìn)行深入的研究。

1.2.2SjVAL2基因的擴(kuò)增 根據(jù)已獲得的編碼序列,利用DNAClub和PCRdesign設(shè)計引物。上游 引 物 5′-TGCUGGATCCUATTCATT TACT TTATCAACC-3′,帶BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn);下游引物5′-GTGUCTCGAGUTCATCTATTACATAACAAGGTC-3′,帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板,95℃預(yù)變性10min后,熱循環(huán)參數(shù)為 95℃1min,54℃1min,72℃1min,共 32個循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjVAL2的構(gòu)建和鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收,連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR,雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá) 將確定能表達(dá)重組蛋白的單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到1 000 mL培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至A600約為0.6時加入IPTG至終濃度為 l mmol/L,37℃250 r/min進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)5h后離心收菌,分別取上清和沉淀行SDS-PAGE電泳檢測蛋白的表達(dá)。

1.2.5 菌體裂解、重組蛋白的純化 按照上述方法對陽性克隆進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體,按每克菌體加入4 mL結(jié)合緩沖液重懸菌體,冰上放置30min后冰上超聲裂解(功率150 W,持續(xù) lS,停2S,共 15min),4℃,13 000 r/min離心20min收集沉淀。重組蛋白的純化按Liu SenP[5]的方法進(jìn)行,簡而言之,首先用含1%SDS+0.1%β-巰基乙醇的PBS溶解包涵體,100℃加熱煮沸10min后,用含0.1%SDS的 PBS溶液透析2次后,最后用含0.1%SDS的1×結(jié)合緩沖液透析后過柱純化,純化步驟參照Ni-IDA Agarose說明書進(jìn)行,只是所有的緩沖液均含有0.1%SDS,純化后的蛋白用PBS透析去除SDS,蔗糖濃縮后進(jìn)行蛋白濃度測定,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 免疫印跡法檢測重組蛋白的免疫反應(yīng)性將純化的重組蛋白行12%SDS-PAGE電泳,于100V冰浴轉(zhuǎn)印1.5h,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%脫脂奶粉 4℃封閉過夜,PBS洗滌 3次,每次5min,分別轉(zhuǎn)入抗6×His單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、日本血吸蟲感染小鼠血清(1∶100稀釋)和正常小鼠血清(1∶100稀釋)中,室溫孵育2h,PBS洗滌3次,每次5min。然后于辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀釋)中室溫孵育1h,PBS洗滌后DAB顯色,去離子水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析 以Vv Vesv5為檢索源,通過tBLASTn檢索S.japonicumEST數(shù)據(jù)庫,共搜索出65條EST序列,經(jīng)過序列比列,排除重復(fù)序列,共得到17條Unigene。NCBI保守結(jié)構(gòu)域搜索,發(fā)現(xiàn)它們均具有SCP保守結(jié)構(gòu)域;多序列比對分析發(fā)現(xiàn)S.japonicumSCP/TAPS蛋白可以分成三個亞組(圖1),首先相較于第一組和第三組,第二組各成員存在一個相同的缺失區(qū)域(D1,圖1);其次,第一組和第三組各蛋白所具有的保守半胱氨酸殘基,第二組中的蛋白均沒有;再次,目前為止有報道的植物寄生線蟲 SCP/TAPS蛋白的標(biāo)志之一——H YTQ保守基序在這三個組中均不相同P[6]。SjVAL2(AAW24579)屬于第一組。SjVAL2基因全長654bp,編碼區(qū)為15～596bp,編碼193個氨基酸,同源比對分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與曼氏血吸蟲SmVAL12一致性最高,達(dá)60%。

圖1 日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白家族多序列比對圖Fig.1 Multiple sequence alignment of S.japonicum SCP/TAPS family

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將重組質(zhì)粒行PCR和雙酶切鑒定,產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳,在500～750bp之間有一清晰條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白表達(dá)純化結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21/DE3中,SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示如圖3,第5泳道約25 kDa處出現(xiàn)表達(dá)條帶,與目的蛋白分子量基本相符;第6泳道顯示為蛋白純化結(jié)果,純化后測得蛋白濃度約0.6 mg/mL。

2.4 免疫反應(yīng)性分析 Western-bloting顯示,用日本血吸蟲感染的小鼠血清(圖4第1道)和抗His單克隆抗體(圖4第2道)能識別純化的重組蛋白,而正常小鼠血清(圖4第3道)則不能識別。

3 討 論

在病原體入侵宿主的過程中,許多蛋白、因子參與病原體——宿主的相互作用,如感染的發(fā)生和保持、激活或逃避宿主的免疫應(yīng)答以及導(dǎo)致宿主病理的損傷。不同的蛋白超家族在病原體與宿主的相互作用中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能,sperm-coating protein(SCP)樣蛋白就是其中的一員。SCP樣蛋白也稱為 SCP/Tpx-1/Ag5/PR-1/Sc7(SCP/TAPS),在許多真核生物中均發(fā)現(xiàn)有SCP/TAPS蛋白的存在,如果蠅、秀麗隱桿線蟲、曼氏血吸蟲、哺乳動物等[7-10]。不同物種中的SCP/TAPS蛋白一級結(jié)構(gòu)具有一定的同源性,就是在一段信號肽后面是一個SCP保守結(jié)構(gòu)域;不同物種之間以及同一物種內(nèi)不同SCP/TAPS蛋白氨基酸序列也存在著顯著的變異。有研究報道一些物種SCP/TAPS蛋白家族可以分為不同的亞群,如線蟲SCP/TAPS蛋白家族可以分為3種類型P[11];果蠅和曼氏血吸蟲則可分為2種亞群[7,9]。通過以黃蜂VvVesv5為檢索源,tBLASTn檢索日本血吸蟲EST數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲中SCP/TAPS蛋白家族的存在,目前發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲有17個SCP/TAPS蛋白成員;多序列比對分析后,我們發(fā)現(xiàn)相對于曼氏血吸蟲而言它們存在更多的變異,但基本上可以分為3個亞群(圖1)。

圖2 重組質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定圖M ：DNA marker(DL 2000);1：PCR 產(chǎn)物;2：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjVAL2雙酶切;3：空質(zhì)粒 pET-28a(+)雙酶切Fig.2 The identification of pET-28a(+)-SjVAL2 by PCR and digestion with restriction enzymesM ：DL 2000 marker;1：PCR amplification;2：recombinant pET-28a(+)-SjVAL2 digested with BamHⅠand XhoⅠ restriction enzymes;3：empty pET-28a(+)digested with BamHⅠand XhoⅠ

圖3 重組質(zhì)粒原核表達(dá)產(chǎn)物的12%SDS-PAGE電泳分析M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)質(zhì)粒IPTG未誘導(dǎo);2：pET-28a(+)質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo);3：重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-SjVAL2 IPTG未誘導(dǎo);4：重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-SjVAL2 IPTG誘導(dǎo);5：超聲后沉淀;6：純化重組蛋白Fig.3 12%SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purified productM ：protein marker;1：pET-28a(+)without IPTG induction;2：pET-28a(+)after IPTG induction;3：pET-28a(+)-SjVAL2 without IPTG induction;4：pET-28a(+)-SjVAL2 inducted with IPTG;5：precipitants of lysate of E.coli with pET-28a(+)-SjVAL2 induced with IPTG;6：purified rSjVAL2

圖4 純化重組蛋白Western-blotting分析M：蛋白Marker;1：日本血吸蟲感染小鼠血清;2：抗His單克隆抗體;3：正常小鼠血清Fig.4 Western blot analysis of rSjVAL2M,protein marker;1：rSjVAL2 probed with mouse serum infected with S.japonicum;2：with mAb-His;3：with normal mouse serum

SCP/TAPS蛋白在真核生物中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,大多數(shù)SCP/TAPS蛋白為分泌性蛋白在細(xì)胞外起作用。目前,SCP/TAPS家族蛋白的確切功能還不是很清楚,不同物種有不同的功能報道,如免疫應(yīng)答、生殖、病原體入侵、變態(tài)反應(yīng)等,同時也是疫苗候選分子之一[12-14]。為研究日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白家族的功能,我們從中挑選出SjVAL2為代表作進(jìn)一步的研究。在本研究中,我們成功構(gòu)建了SjVAL2原核表達(dá)質(zhì)粒,并獲得重組表達(dá)蛋白。Western-blotting結(jié)果顯示重組蛋白可被日本血吸蟲感染小鼠血清識別,證實(shí)重組蛋白具有免疫反應(yīng)性,為進(jìn)一步研究日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白家族的功能打下基礎(chǔ),但日本血吸蟲SCP/TAPS蛋白家族的具體功能還有待于進(jìn)一步的研究。

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