張克山,劉永杰,盧國(guó)棟,劉湘濤

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患傳染病。口蹄疫的暴發(fā)和流行帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和不良的政治影響,同時(shí)對(duì)人們身體健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病之首。FMDV基因組RNA全長(zhǎng)約為 8.5kb,由 5′非翻譯區(qū)(5′U TR),開(kāi)放閱讀框架(ORF)和 3′非翻譯區(qū) (3′U TR)組成 ,尾部帶有PolyA(圖 1)。5′U TR 全長(zhǎng)約 1 300bp,最前端是VPg,緊接著是S片段、Poly(C)區(qū)段,功能未知區(qū)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)[1]。ORF長(zhǎng)約7.0kb編碼聚合蛋白由L基因、P1結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成,此聚合蛋白隨后逐漸被降解為病毒所需的各種組分:Lab/Lb、1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)、2A。3′U TR 長(zhǎng)約 172bp,為高度的莖環(huán)結(jié)構(gòu),與病毒基因組復(fù)制相關(guān),由poly(A)以及poly(A)和P3區(qū)之間的堿基組成。了解FMDV基因組結(jié)構(gòu)及功能有助于該病的快速診斷和新型疫苗的開(kāi)發(fā),本文詳細(xì)闡述了FMDV的基因組結(jié)構(gòu)中每個(gè)基因的最新研究進(jìn)展。

1 FMDV 5′UTR

FMDV 5′U TR包括:Vpg、S 片段、Poly(C)區(qū)段、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site,IRES)、擬節(jié)、cre 等結(jié)構(gòu)[1]。

圖1 FMDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖(引自參考文獻(xiàn)[3])Fig.1 Schematic diagram of FMDVgenome structure(cited from reference[3])

1.1 Vpg 、S 片段、Poly(C)區(qū)段、PKs和 cre區(qū)段Vpg實(shí)質(zhì)上是由FMDV 3B基因編碼的蛋白,這種蛋白的酪氨酸殘基與RNA 5′末端尿嘧啶通過(guò)磷酸二脂鍵共價(jià)相連,VPg蛋白不是FMDV病毒感染性所必需基因,但它在病毒粒子包裝和起始病毒RNA合成以及在RNA指數(shù)合成到線性合成過(guò)程中扮演開(kāi)關(guān)調(diào)控作用。S片段長(zhǎng)約360 bp,高度保守且5′和3′端相互配對(duì),形成三葉草狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)。推測(cè)S片段可能是聚合酶的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),對(duì)FMDV的復(fù)制、致病性和宿主范圍有一定的影響[3]。研究者在研究關(guān)于FMDV感染性克隆時(shí)發(fā)現(xiàn):只有當(dāng)C的數(shù)目超過(guò)一定閾值后病毒才能夠獲得拯救[4]。緊接 Poly(C)區(qū)段的是3～4個(gè) RNA假結(jié)(Pseudoknots,PKs)[5],不同毒株假結(jié)的長(zhǎng)度不同,但是這些RNA PKs在 FMDV病毒中扮演什么角色還不得而知。Cre呈“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)緊接在 FMDV RNA PKs后,這一結(jié)構(gòu)首先發(fā)現(xiàn)于人的鼻病毒,是小核糖核酸病毒復(fù)制所必須的基因[6]。

1.2 IRES、Lpro內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site IRES)同時(shí)存在于小RNA病毒科其它屬RNA病毒和一些細(xì)胞內(nèi)mRNA中[7]。IRES為高度保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu),二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定,含有FMDV基因組RNA不同功能區(qū)及與細(xì)胞因子相互作用的位點(diǎn)[8]。小 RNA病毒通過(guò)IRES進(jìn)行不依賴(lài)于帽子結(jié)構(gòu)的方式起始翻譯,這解釋了為什么小RNA病毒的蛋白酶在沒(méi)有破壞自己基因組翻譯的前提下能關(guān)閉宿主細(xì)胞蛋白的合成。在 FMDV中,多肽鏈?zhǔn)窃?IRES 3’端AU G及下游84nt處AU G兩個(gè)不同密碼子處起始翻譯[9]。引導(dǎo)蛋白酶(Leader proteinase,Lpro)是由 FMDV L基因編碼具有木瓜蛋白酶活性。其主要功能是Lpro能將自身從多肽鏈的C-末端切割下來(lái),并降解宿主翻譯起始因子eIF4G[10],同時(shí)決定病毒的毒力[11],抑制Ⅰ型干擾素的翻譯[12]。

2 FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因

FMDV結(jié)構(gòu)基因 P1全長(zhǎng)約2.2kb,含有1A、1B、1C和1D 4個(gè)基因,分別編碼 VP4、VP2、VP3和VP1。VP0是VP2和VP4的前體,VP1、VP2、VP3位于FMDV衣殼的表面,VP4位于衣殼的內(nèi)部[13]。病毒衣殼蛋白的組成為:4種結(jié)構(gòu)蛋白各一分子組成1個(gè)原體,每5個(gè)原體通過(guò)一種脲敏感結(jié)合區(qū)域聚集在一起,形成1個(gè)五聚體,12個(gè)五聚體借助組氨酸聚合形成病毒的空衣殼[14]。在 FMDV病毒衣殼表面VP1基因的第140～160位氨基酸組成的明顯突出衣殼表面的 G-H環(huán),含有甘氨酸-精氨酸-天門(mén)冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列,其功能與纖維蛋白及整合素結(jié)合相關(guān),是FMDV與細(xì)胞受體結(jié)合所必須序列[15]。研究發(fā)現(xiàn)RGD雖然是FMDV結(jié)合細(xì)胞所必須的序列,但不是特異性的序列,其他的病毒也有同樣的序列。RGD附近的基序是高度變異的,推測(cè)是這個(gè)高度的變異區(qū)和RGD高度保守區(qū)的結(jié)合才使得FMDV感染細(xì)胞具有特異性。研究表明RGD的受體是宿主細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白(integrin),αVβ3是 FMDV的細(xì)胞受體[16-17]之一,除整聯(lián)蛋白外其他分子也能作為FMDV的受體,如硫酸乙酰肝素,近期研究還發(fā)現(xiàn)FMDV能夠不依賴(lài)αVβ3和乙酰肝素而進(jìn)入細(xì)胞,這表明FMDV還有其他的類(lèi)型的受體,能通過(guò)多種途徑進(jìn)入細(xì)胞[18]。

3 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白基因

FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白基因包括P2和P3編碼區(qū),其中P2區(qū)編碼2A、2B、2C蛋白,P3區(qū)編碼3A、3B、3C和3D蛋白。

3.1 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白P2基因 P2基因被裂解為2A、2B和2C,2A蛋白含有18個(gè)氨基酸的多肽,在多聚蛋白初級(jí)切割過(guò)程中,能通過(guò)自身切割與結(jié)構(gòu)蛋白P1相分離。2B和2C蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的小泡上具有輔助病毒誘導(dǎo)細(xì)胞病變作用,2C蛋白是膜結(jié)合蛋白,是起始負(fù)鏈RNA合成所必需的蛋白[19],2C蛋白具有ATPase和 GTPase活性,同時(shí)2C蛋白有助于新合成 FMDV衣殼的裝配,能誘使FMDV在細(xì)胞出芽式增殖[20-21]。

3.2 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白P3基因 P3基因由3A、3B、3C、3D共同組成。3A具有膜相關(guān)性,被認(rèn)為是小RNA病毒復(fù)制復(fù)合體與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合的錨定蛋白,與病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理效應(yīng)和阻斷宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的分泌有關(guān)。1997年我國(guó)臺(tái)灣暴發(fā)的 FMDV分離株中發(fā)現(xiàn)了3A基因在C未端19至20氨基酸的缺失,降低了FMDV對(duì)牛的致病能力以及在牛源細(xì)胞上的生長(zhǎng)能力。但是沒(méi)有直接的證據(jù)表示是由于3A基因的缺失才導(dǎo)致上述現(xiàn)象的出現(xiàn)[22]。

3B蛋白是由P3非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)3個(gè)相連但不完全相同的基因編碼,可以產(chǎn)生3種不同的3B蛋白(Vpg),這是RNA病毒中少有的核苷酸豐余現(xiàn)象[23]。VPg蛋白參與 RNA的起始合成以及在病毒RNA的衣殼形成中發(fā)揮重要的作用。由于VPg攜帶有pUpU結(jié)構(gòu)與新合成的子代RNA相連,因此VPg被認(rèn)為是小RNA病毒RNA合成的引物,這種特殊的RNA復(fù)制方式與宿主mRNA轉(zhuǎn)錄不同,因而在宿主 RNA合成受到抑制時(shí),并不影響FMDV RNA的合成。VPg基因的拷貝數(shù)與RNA病毒的感染力呈正相關(guān),VPg突變將導(dǎo)致病毒生命周期延長(zhǎng),這也意味著聚合蛋白合成和加工推遲,感染性粒子數(shù)目減少。

3C蛋白具有酶活性[24],FMDV大部分多聚蛋白的切割都是由它完成,同時(shí)3C在裂解宿主蛋白中起著重要的作用。脊髓灰質(zhì)病毒3Cpro參與RNA聚合酶II介導(dǎo)的特異性轉(zhuǎn)錄因子的切割;在FMDV感染早期,3Cpro能切去組氨酸 H3N-未端20個(gè)氨基酸但被截?cái)嗟慕M氨酸仍然附著在染色體上[25]最近研究證實(shí)FMDV 3Cpro能切割具有RNA螺旋酶作用的eIF4A[26]。3D蛋白又稱(chēng) FMDV感染相關(guān)抗原(FMD-VIAA),是 FMDV毒編碼的 RNA多聚酶,核苷酸和氨基酸序列具有高度保守性,具有催化病毒RNA合成的功能。3D蛋白除具有RNA依賴(lài)的RNA聚合酶功能外,還具有VPg尿苷化,末端腺苷轉(zhuǎn)移酶及與3’U TR和3AB形成 RNP復(fù)合物的功能[27]。

4 FMDV 3’UTR

小核糖核酸RNA病毒基因組包括一個(gè)和3D蛋白酶相分離的Poly(A)區(qū)段而且能夠折疊成特殊的結(jié)構(gòu)[28],平均長(zhǎng)度一般在35～100個(gè)堿基;和細(xì)胞中的mRNA不同的是細(xì)胞中mRNA Poly(A)是轉(zhuǎn)錄后經(jīng)修飾加入的,而小核糖核酸的 Poly(A)是基因組編碼的[29]。Poly(A)的存在能使 FMDV轉(zhuǎn)錄及時(shí)有效的終止。另外根據(jù)Poly(A)越短病毒感染性越低的特點(diǎn),推測(cè) Poly(A)可能與病毒的毒力有關(guān)。

[1]Brown F.Vaccination today and tomorrow[J].Biosci Rep,1995,15(6):493-502.

[2]Bull JJ,Meyers LA,Lachmann M.Quasispecies made simple[J].Plos Comput Biol,2005,1(6):450-460.

[3]Grubman MJ,Moraes MP,Segundo FDS,et al.Evading the host immune response:how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen[J].Fems Immunol Med Mic,2008,53(1):8-17.

[4]Mason PW,Grubman MJ,Baxt B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J].Virus Res,2003,91(1):9-32.

[5]Zibert A,Maass G,Strebel K,et al.Infectious foot-and-mouth disease virus derived from a cloned full-length cDNA[J].J Virol,1990,64:2467-2473.

[6]Clarke B E,Sangar D V,Burroughs J N,et al.Two initiation sites for foot-and-mouth disease virus polyprotein in vivo[J].J Gen Virol,1985,66:2615-2626.

[7]Lemon S M,Murphy P C,Shields P A,et al.Antigenic and genetic variation in cytopathic hepatitis A virus variants arising during persistent infection:evidence for genetic recombination[J].J Virol,1991,65:2056-2065.

[8]Macejak D G,Sarnow P.Internal initiation of translation mediated by the 5’leader of a cellular mRNA[J].Nature,1991,353:90-94.

[9]Meyer K,Petersen A,Niepmann M,et al.Interaction of eukaryotic initiation factor eIF-4B with a picornavirus internal translation initiation site[J].J Virol,1995,69:2819-2824.

[10]Beck E,Strohmaier K.Subtyping of european foot-and-mouth disease virus strains by nucleotide sequence determination[J].J virol,1987,61(5):1621-1629.

[11]Devaney M A,Vakharia V N,Lloyd R E,et al.Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex[J].J Virol,1988,62:4407-4409.

[12]Mason P W,Rieder E,Baxt B.RGD Sequence of foot-andmouth disease virus is essential for infecting cells via the natural receptor but can be bypassed by an antibody-dependent enhancement pathway[J].Proc Nal Acad SciUSA,1994,91:1932-1936.

[13]Brown C C,Chinsangaram J,Grubman M J.Type I interferon production in cattle infected with 2 strains of foot-and-mouth disease virus,as determined by in situ hybridization[J].Can J Vet Res,2000,64:130-133.

[14]Ryan MD,Belsham GJ,King AM.Specificity of enzymesubstrate interactions in foot-and-mouth disease virus polyprotein processing[J].Virology,1989,173(3):35-45.

[15]謝慶閣.口蹄疫[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004.

[16]Leippert M,Beck E,Weiland F,et al.Point mutations within the(G-(H loop of foot-and-mouth disease virus O1K affect virus attachmentto targetcells[J].J Virol,1997,71:1046-1051.

[17]Berinstein A,Roivainen M,Hovi T,et al.Antibodies to the vitronectin receptor(integrinαvβ3)inhibit binding and infection of foot-and-mouth disease virus to cultured cells[J].J Virol,1995,69:2664-2666.

[18]Jackson T,Ellard F M,Ghazaleh R A,et al.Efficient infection of cells in culture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cell surface heparan sulfate[J].J Virol,1996,70:5282-5287.

[19]Baranowski E,Ruiz-Jarabo,Sevilla N,et al.Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrinbinding motif:flexibility in aphthovirus receptor usage[J].J Virol,2000,74:1641-1647.

[20]Barton D J,Flanegan J B.Synchronous replication of poliovirus RNA:initiation of negative-strand RNA synthesis requires the guanidine-inhibited activity of protein 2C[J].J Virol,1997,71:8482-8489.

[21]Bienz K,Egger D,Pfister T,et al.Structural and functional characterization of the poliovirus replication complex[J].J Virol,1992,66:2740-2747.

[22]Andino R,Rieckhof G E,Baltimore D.A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5’end of poliovirus RNA[J].Cell,1990,63:369-380.

[23]Knowles N J,Davies P R,Henry T,et al.Emergence in Asia of foot-and-mouth disease viruses with altered host range:characterization of alterations in the 3A protein[J].J Virol,2001,75:1551-1556.

[24]King AM,Sangar DV,Harris TJ,et al.Heterogeneity of the genome-linked protein of foot-and-mouth disease virus[J].J Virol,1980,34(5):627-634.

[25]Klump W,Marquardt O,Hofschneider P H.Biologically active protease of foot and mouth disease virus is expressed from cloned viral cDNA in Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:3351-3355.

[26]Grigera P R,Tisminetzky S G.Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus[J].Virology,1984,136:10-19.

[27]Belsham GL,McInerney G M,Ross-Smith N.Foot-and-mouth disease virus 3C protease induces cleavage of translation initiation factors eIF4A and eIF4G within infected cells[J].J Virol,2000,74:272-280.

[28]Plotch S J,Palant O.Poliovirus protein 3AB forms a complex with and stimulates the activity of the viral RNA polymerase,3Dpol[J].J Virol,1995,69(11):7169-7179.

[29]Pilipenko E V,Blinov V M,Romanova L I,et al.Conserved structural domains in the 5’-untranslated region of picornaviral genomes:an analysis of the segment controlling translation and neurovirulence[J].Virology,1989,168:201-209.