柳忠玉 莊楚雄 生書晶 邵利 趙樹進

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006;2.華南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，廣東廣州510642;3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東廣州510010)

白藜蘆醇是含有萜類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，化學名稱為3，5，4'-三羥基二苯乙烯.它是許多植物受到生物或非生物脅迫(如真菌感染、紫外照射等)時產(chǎn)生的一種植物抗毒素.白藜蘆醇在自然界主要存在4種形式:順式、反式白藜蘆醇以及順式、反式白藜蘆醇苷.白藜蘆醇以及白藜蘆醇苷具有廣泛的生物學功能，包括抗腫瘤［1］、保護心血管系統(tǒng)［2］、抗氧化［3］、抗菌等［4］.

白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖、決明子和花生等天然植物或果實當中，到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中被發(fā)現(xiàn)，其中葡萄、虎杖、花生是白藜蘆醇含量較高的3種植物.虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥;與葡萄、花生相比較，虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的總含量最高［5］，其根莖中白藜蘆醇苷含量高達 1750μg/g(干重)［6］.

白藜蘆醇合酶(RS)(EC 2.3.1.95)，是白藜蘆醇合成代謝途徑中最后一個起作用的關(guān)鍵酶，也是合成途徑中唯一必需的合成酶，以4-香豆酰輔酶 A和丙二酰輔酶A為底物合成白藜蘆醇.白藜蘆醇合酶基因在植物中往往以基因家族存在，例如基因組測序顯示，葡萄中的白藜蘆醇合酶基因高達43個，其中20個已經(jīng)被表達［7］.為了提高植物抗病性或提高目標植物中白藜蘆醇含量，許多研究者將分離到的白藜蘆醇合酶基因轉(zhuǎn)入不含有該基因的植物中，其中用于植物轉(zhuǎn)化的最常用的基因是來源于葡萄的Vst1 和 Stsy基因［8］，另外花生的 AhRS 基因［9］、高粱的SbSTS1基因［10］、爬山虎的STS基因也被成功用于轉(zhuǎn)化實驗［11］.由于植物次生代謝的復(fù)雜性和種屬特異性，在轉(zhuǎn)基因植物中一些目標基因的超表達可能并未提高預(yù)期代謝產(chǎn)物的合成量，例如在轉(zhuǎn)基因水稻［12］、蘋果中沒有檢測到白藜蘆醇或白藜蘆醇苷［13］.虎杖白藜蘆醇合酶基因 PcRS已經(jīng)被分離(GenBank登錄號:DQ900615)，但是將PcRS基因?qū)胫参锊⒊晒铣砂邹继J醇或白藜蘆醇苷的研究鮮見報道;本研究將該基因置于花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子下，構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，檢測該基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達以及終產(chǎn)物，為虎杖白藜蘆醇合酶基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料、菌種和試劑

擬南芥(Arabidopsis thaliana)為哥倫比亞生態(tài)型(Col).虎杖采集于廣州中醫(yī)藥大學苗圃.大腸桿菌菌株 DH10B、農(nóng)桿菌 LBA4404菌株、克隆載體pUC19、植物表達載體pCAMBIA1380由華南農(nóng)業(yè)大學植物基因組學與生物技術(shù)重點實驗室保存.限制性內(nèi)切酶、連接酶等為TaKaRa公司產(chǎn)品.地高辛標記檢測試劑盒購自羅氏公司.

1.2 植物表達載體的構(gòu)建

首先將組成型表達的35S啟動子連接在pUC19的EcoR I/Kpn I位點，得到質(zhì)粒pUC19-35S.其次，依據(jù)PcRS cDNA開放閱讀框設(shè)計引物P1(5'CCGGTACCATGGCAGCTTCAACTGAAG3')和P2(5'CCGGATCCTTAAATGATGGGCACACTTC3')，以虎杖嫩葉cDNA為模板擴增PcRS基因，擴增片段大小為1167bp.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)條件為:94℃ 預(yù)變性2min;94℃變性30s，60℃退火 30s，72℃ 延伸30s，共30個循環(huán);最后72℃ 延伸10 min.將PCR產(chǎn)物連接到pUC19-35S質(zhì)粒的Kpn I/BamH I位點，得到pUC19-35S-PcRS.再對pUC19-35S-PcRS進行EcoR I/BamH I雙酶切，把酶切片段(包括35S啟動子和PcRS基因)連接到載體pCAM1380上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1380-35S-PcRS(見圖1).測序驗證插入片段的序列正確后用于轉(zhuǎn)化實驗.

圖1 pCAMBIA1380-35S-PcRS構(gòu)建示意圖Fig.1 Schema of pCAMBIA1380-35S-PcRS structure

1.3 花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥和轉(zhuǎn)化子篩選

擬南芥種子播種于盛滿培養(yǎng)土的培養(yǎng)杯，再置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為16h光照/8h黑暗，生長約4周后，擬南芥植株開始開花，剪去已開花的主莖，使其頂端優(yōu)勢受到抑制而抽出大量側(cè)枝，側(cè)枝開花時用于花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥［14］.制備好含pCAMBIA1380-35S-PcRS的農(nóng)桿菌菌液10 mL，在轉(zhuǎn)化前1d，轉(zhuǎn)入含卡那霉素50 μg/mL的液體培養(yǎng)基過夜;第2天，振蕩培養(yǎng)至吸光值D(600)在1.2～1.6之間時取出使用.室溫3000g離心10 min，棄上清，沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+蔗糖5%+Silwet L-77200 μL/L)中，菌液吸光值D(600)控制在0.8左右.將農(nóng)桿菌懸浮液倒在小燒杯中，將長有擬南芥的培養(yǎng)杯倒扣其上，保證蓮座葉以上部分浸沒于液體中，浸泡10min后取出植株，橫放在塑料盤中，用保鮮膜封好以保持濕度，放在恒溫室培養(yǎng).第2天豎直培養(yǎng)，仍用保鮮膜保持濕度2～3d.根據(jù)情況可再浸染一次.培養(yǎng)3～4周待種子成熟后收取種子.收獲的T0代種子經(jīng)表面消毒后接種到篩選培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+3% 蔗糖+0.8%瓊脂+20mg/L潮霉素)上篩選陽性轉(zhuǎn)化株.對經(jīng)潮霉素篩選獲得的抗性植株進行潮霉素基因PCR檢測，PCR引物為P3(5'CGCCGATGGTTTCTACAA3')和P4(5'-GGCGTCGGTTTCCACTAT 3').擴增條件為:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30s，共28個循環(huán);最后72℃ 延伸10min，預(yù)期擴增片段大小為500bp.

1.4 Southern雜交檢測

對經(jīng)PCR鑒定為陽性的植株進行Southern雜交檢測.利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取葉片基因組DNA，基因組DNA 10μg經(jīng)EcoR I酶切過夜，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA.電泳結(jié)束后，把凝膠浸在變性液(0.5 mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)中輕輕晃動15 min，重復(fù)1次;然后把凝膠浸在中和液中(0.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，1.5mol/L NaCl)輕輕晃動 15min，重復(fù) 1 次;在20倍檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中平衡凝膠至少10min.再以20倍SSC溶液為印跡轉(zhuǎn)移緩沖液，利用毛細管虹吸印跡法將 DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外交聯(lián)5min固定DNA.以PcRS cDNA為探針模板，用地高辛隨機引物標記試劑盒進行標記.42℃預(yù)雜交1 h后，加入探針雜交16 h.洗膜條件:在65℃用2倍SSC溶液(含0.1%十二烷基磺酸鈉)漂洗5min，重復(fù)1次;然后用0.1倍SSC溶液(含0.1%十二烷基磺酸鈉)漂洗15min，重復(fù)1次，最后用地高辛檢測試劑盒檢測雜交信號.

1.5 Northern雜交檢測

在轉(zhuǎn)基因植株T3代的純合子株系和野生型幼苗生長兩周后，提取擬南芥幼苗總RNA，用甲醛變性凝膠進行電泳，之后將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，交聯(lián)5min固定RNA，同樣以PcRS cDNA為制備探針的模板，探針標記及雜交、檢測方法與Southern雜交相同.

1.6 HPLC法測定提取物含量

轉(zhuǎn)基因植株T3代的純合子品系和野生型幼苗生長兩周后，取擬南芥幼苗0.3g，經(jīng)液氮研磨后，加入3mL 80%(體積分數(shù))甲醇避光浸提12 h后，待測.色譜柱為SunFireTM C18(4.6 mm×250.0 mm)，流動相為乙腈和水，其體積比為25∶75，流速為1.0mL/min，檢測波長為306nm，柱溫為25℃.

2 結(jié)果與分析

2.1 PcRS基因轉(zhuǎn)化擬南芥表達載體檢測

35S啟動子大小為794bp，PcRS cDNA開放閱讀框序列長1167bp，則總的插入片段大小為1961bp.用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1380-35S-PcRS，能夠切出與插入片段大小一致的片段(見圖2)，說明成功構(gòu)建了帶有PcRS基因的植物表達載體.

圖2 質(zhì)粒pCAMBIA1380-35S-PcRS鑒定Fig.2 Identification of plasmid pCAMBIA1380-35S-PcRS M—DNA標準物;P—pCAMBIA1380-35S-PcRS

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的篩選與PCR鑒定

取從抗性擬南芥植株葉片中提取的DNA作為擴增模板，用潮霉素基因特異引物P3和P4進行PCR擴增，電泳結(jié)果(見圖3)表明，所檢測的8個株系中有7個株系(2－8)約在500 bp處擴增到潮霉素基因片段帶，而未轉(zhuǎn)化擬南芥DNA樣品未見目的帶，初步驗證這7個株系為陽性植株.

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因株系的PCR鑒定Fig.3 PCR analysis in T0transgenic plants

2.3 外源基因整合與表達

對經(jīng)過PCR初步驗證的陽性植株做Southern雜交檢測，結(jié)果(見圖4)發(fā)現(xiàn):所檢測的7個株系中，有4個株系(3，6－8)有明顯的雜交信號，PcRS基因拷貝數(shù)介于1至4之間，株系7為單拷貝整合，株系6和8為3拷貝，株系3為4拷貝，說明PcRS基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中;其余3個株系無雜交信號.

圖4 Southern blotting法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代Fig.4 Southern blotting analysis of transgenic Arabidopsis thaliana T0lines

選擇單拷貝整合株系7為研究對象，株系7的T0代成熟后收獲T1代種子，潮霉素篩選T1代種子，未黃化植株成熟后收獲T2代種子，T2代經(jīng)篩選已經(jīng)能夠得到穩(wěn)定遺傳的T3代純合子株系，編號為T3-7，然后對純合的轉(zhuǎn)基因株系進行表達分析.用Northern雜交檢測外源基因在單拷貝轉(zhuǎn)基因純合系T3-7中的表達情況，結(jié)果(見圖5)顯示，外源PcRS基因已在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達，而未轉(zhuǎn)化擬南芥中沒有雜交信號.

2.4 提取物含量

圖5 Northern blotting法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代Fig.5 Northern blotting analysis of transgenic Arabidopsis thaliana T3lines

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉中反式白藜蘆醇苷的HPLC分析Fig.6 HPLC analysis of trans-piceid in the leaves of transgenic Arabidopsis thaliana

利用HPLC法檢測轉(zhuǎn)基因純合子株系T3-7是否能生成白藜蘆醇或白藜蘆醇苷.對純合子株系T3-7及非轉(zhuǎn)基因擬南芥提取物進行色譜分析，發(fā)現(xiàn)T3-7產(chǎn)生明顯新峰(見圖6(a))，保留時間為7.5min，與反式白藜蘆醇苷對照品(見圖6(c))相符，而未轉(zhuǎn)化植株沒有此峰(見圖6(b))，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥合成產(chǎn)物是白藜蘆醇苷而不是白藜蘆醇.進一步分析表明，轉(zhuǎn)基因純合子株系T3-7中反式白藜蘆醇苷的含量為136μg/g(鮮重)，干重為1813μg/g.

轉(zhuǎn)基因純合子株系T3-7中產(chǎn)生的是白藜蘆醇苷而不是白藜蘆醇，可能是由于植物體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用［15］，在轉(zhuǎn)基因白楊［16］、番木瓜［17］、油菜中也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象［18］.白藜蘆醇苷存在順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，本研究將PcRS基因轉(zhuǎn)入擬南芥只檢測到了反式白藜蘆醇苷，而Yu等［10］將高粱SbSTS1轉(zhuǎn)入擬南芥的主要代謝物是順式白藜蘆醇苷，這可能是由于擬南芥植物體內(nèi)異構(gòu)酶的作用.多年生虎杖根莖中白藜蘆醇苷含量為 1750 μg/g(干重)［6］，一年生虎杖根莖中白藜蘆醇苷含量僅為26.88 μg/g(干重)［19］，而本研究中生長兩周的純合子株系T3-7幼苗產(chǎn)生白藜蘆醇苷的含量為1813 μg/g(干重)，比一年生虎杖根莖中的含量高60多倍，這為反式白藜蘆醇苷藥理學研究提供了便利資源，具有潛在的研究應(yīng)用價值.

3 結(jié)語

本研究將基因PcRS置于CaMV 35S啟動子下，構(gòu)建組成型表達植物轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥、潮霉素篩選和PCR鑒定初步得到陽性植株，Southern雜交結(jié)果進一步證實PcRS外源片斷已經(jīng)整合到擬南芥基因組中，Northern雜交證實外源基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥純合子株系T3-7中實現(xiàn)了表達，HPLC法檢測到終產(chǎn)物是反式白藜蘆醇苷，其含量為136μg/g(鮮重)，干重為1813μg/g.本研究結(jié)果表明PcRS基因在擬南芥中過量表達能促進反式白藜蘆醇苷的合成，這為PcRS基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ).下一步將對轉(zhuǎn)基因株系進行抗病性研究，探討PcRS是否能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗病性.

［1］ Fulda S，Debatin K.Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy［J］.Oncogene，2006，25(34):4798-4811.

［2］ Mokni M，Limam F，Elkahoui S，et al.Strong cardioprotective effect of resveratrol，a red wine polyphenol，on isolated rat hearts after ischemia/reperfusion injury［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，457(1):1-6.

［3］ Jefremov V，Zilmer M，Zilmer K，et al.Antioxidative effects of plant polyphenols:from protection of G protein signaling to prevention of age-related pathologies［J］.Annals of New York Academy of Sciences，2007，1095(5):449-457.

［4］ Chan M M.Antimicrobial effect of resveratrol on dermato-phytes and bacterial pathogens of the skin［J］.Biochemical Pharmacology，2002，63(2):99-104.

［5］ Burns J，Yokota T，Ashihara H，et al.Plant foods and herbal sources of resveratrol［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2002，50(11):3337-3340.

［6］ Yi T，Zhang H，Cai Z.Analysis of Rhizoma Polygoni Cuspidati by HPLC and HPLC-ESI/MS ［J］.Phytochemical Analysis，2007，18(5):387-392.

［7］ Jaillon O，Aury J M，Noel B，et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla［J］.Nature，2007，449(7161):463-467.

［8］ Delaunois B，Cordelier S，Conreux A，et al.Molecular engineering of resveratrol in plants［J］.Plant Biotechnology Journal，2009，7(1):2-12.

［9］ Lim J，Yun S，Chung I，et al.Resveratrol synthase transgene expression and accumulation of resveratrol glycoside in Rehmannia glutinosa ［J］.Molecular Breeding，2005，16(3):219-233.

［10］ Yu C K，Lam C N，Springob K，et al.Constitutive accumulation of cis-piceid in transgenic arabidopsis overexpressing a sorghum stilbene synthase gene ［J］.Plant Cell Physiology，2006，47(7):1017-1021.

［11］ Liu S，Hu Y，Wang X，et al.High content of resveratrol in lettuce transformed with a stilbene synthase gene of Parthenocissus henryana［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2006，54(21):8082-8085.

［12］ Stark-Lorenzen P，Nelke B.Transfer of a grapevine stilbene synthase gene to rice(Oryza sativa L.)［J］.Plant Cell Reports，1997，16(10):668-673.

［13］ Szankowski I，Briviba K，F(xiàn)leschhut J，et al.Transformation of apple(Malus domestica Borkh.)with the stilbene synthase gene from grapevine(Vitis vinifera L.)and a PGIP gene from kiwi(Actinidia deliciosa)［J］.Plant Cell Reports，2003，22(2):141-149.

［14］ Clough S J，Bent A F.Floral dip:a simplified method for agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana［J］.The Plant Journal，1998，16(6):735-743.

［15］ Kobayashi S，Ding C K，Nakamura Y，et al.Kiwifruits(Actinidia deliciosa)transformed with a vitis stilbene synthase gene produce piceid(resveratrol-glucoside)［J］.Plant Cell Reports，2000，19(9):904-910.

［16］ Giorcelli A，Sparvoli F，Mattivi F，et al.Expression of the stilbene synthase(StSy)gene from grapevine in transgenic white poplar results in high accumulation of the antioxidant resveratrol glucosides［J］.Transgenic Research，2004，13(3):203-214.

［17］ Zhu Y J，Agbayani R，Jackson M C，et al.Expression of the grapevine stilbene synthase gene VST1 in papaya provides increased resistance against diseases caused by Phytophthora palmivora［J］.Planta，2004，220(2):241-250.

［18］ Husken A，Baumert A，Milkowski C，et al.Resveratrol glucoside(Piceid)synthesis in seeds of transgenic oilseed rape(Brassica napus L.)［J］.Theoretical Applied Genetics，2005，111(8):1553-1562.

［19］ 夏海武，呂柳新.虎杖不同部位白藜蘆醇含量的分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2005，14(3):55-56.Xia Hai-wu，Lü Liu-xin.Analysis of resveratrol content in different parts of Polygonum cuspidatum ［J］.Journal of Plant Resources and Environment，2005，14(3):55-56.