李存芝 黃雪松 唐書澤 李琳 張廣文 胡長(zhǎng)鷹

(1.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州510632;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

親和－膜過濾技術(shù)也稱作親和錯(cuò)流過濾，由Adamsi-Medda等［1］于 1981年提出，它將水溶性或非水溶性高分子親和載體與目標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性可逆反應(yīng)，然后用膜進(jìn)行錯(cuò)流過濾，兼具生物親和與膜分離的優(yōu)勢(shì).目前研究非水溶性親和載體的較多，即通過對(duì)濾膜改性，使其具有親和吸附目標(biāo)物質(zhì)的特性，宜于操作［2-3］.水溶性親和載體與目標(biāo)分子在均相中吸附和洗脫，反應(yīng)速度快，達(dá)到平衡時(shí)間短，與非水溶性親和載體比較具有顯著優(yōu)勢(shì).目前相關(guān)的報(bào)道集中在水溶性載體的應(yīng)用［4-8］，在載體的制備及機(jī)理上的較少.

文獻(xiàn)［9］中以合成的相對(duì)分子質(zhì)量為10萬的聚丙烯酰胺為水溶性載體分離胰蛋白酶.考慮到聚丙烯酰胺的潛在不安全性且卵粘蛋白是胰蛋白酶的抑制劑［10］，本研究采用對(duì)人體安全的相對(duì)分子質(zhì)量為200萬的水溶性葡聚糖，對(duì)其活化后連接卵粘蛋白為配基，制備卵粘蛋白－葡聚糖親和載體，以卵粘蛋白作為胰蛋白酶的特異抑制劑，分析載體活化過程的相關(guān)機(jī)理，并將制備的親和超濾載體應(yīng)用于胰蛋白酶的純化.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

葡聚糖 T2000(相對(duì)分子質(zhì)量為200萬).卵粘蛋白、胰凝乳蛋白酶(結(jié)晶純)，均購自Sigma公司;胰蛋白酶(1∶250，即每克酶制劑含250個(gè)酶活力單位)，購自上海伯奧生物科技公司;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.

UV-2102 PC型紫外－可見分光光度計(jì)，由上海UNICO公司生產(chǎn);傅里葉變換紅外光譜儀Vector33，由德國(guó)Bruker公司生產(chǎn);WZZ-1SS數(shù)字式自動(dòng)糖度旋光儀，由上海物理光學(xué)儀器廠生產(chǎn);攪拌式超濾杯(450mL)，由北京中科院膜技術(shù)開發(fā)中心生產(chǎn);聚偏氟乙烯(PVDF)超濾膜，截流相對(duì)分子質(zhì)量為10萬、14萬，由中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所生產(chǎn);ALPHA2-4真空冷凍干燥機(jī)，由德國(guó)Christ公司生產(chǎn).

1.2 親和載體的制備及定量分析

在配料杯中加入葡聚糖T2000和氫氧化鈉，使葡聚糖含量達(dá)到4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，氫氧化鈉濃度達(dá)到0.4mol/L，磁力攪拌器攪拌使溶解完全，加入4%(體積分?jǐn)?shù))的環(huán)氧氯丙烷，攪拌分散均勻;將料液置于60℃恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)2h;反應(yīng)液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10萬的PVDF膜超濾除去溶液中剩余的環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉小分子，冷凍干燥得活化葡聚糖.膜截留物先用蒸餾水洗至pH=8.0，再用pH=9.5的碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液清洗，將卵粘蛋白溶解在上述濾膜截留液中，使卵粘蛋白含量為6g/L，在40℃恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)24 h;反應(yīng)后的溶液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14萬的PVDF膜除去未被偶聯(lián)的卵粘蛋白，真空冷凍干燥，獲得葡聚糖－卵粘蛋白水溶性親和超濾載體.

胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活力的測(cè)定分別采用以 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)、N-乙酰-L-酪氨酸乙酯ATEE為底物的酶活力測(cè)定法［11］.卵粘蛋白配基密度采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色紫外吸收法在595nm 處測(cè)定［11］.

1.3 載體的光譜分析

1.3.1 紫外－可見光吸收光譜分析

分別配制一定濃度的葡聚糖、活化葡聚糖、葡聚糖－卵粘蛋白親和超濾載體，以蒸餾水為空白，在200～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描測(cè)試［12］.

1.3.2 紅外光譜分析

分別取約0.2g干燥的樣品(葡聚糖、活化葡聚糖、葡聚糖－卵粘蛋白親和超濾載體)與200 mg KBr粉末混勻，研磨后，抽真空10min，壓片，在波數(shù)4000～500cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)試.

2 結(jié)果與討論

2.1 葡聚糖載體的活化及分析

葡聚糖載體需要經(jīng)過活化才能與卵粘蛋白配基進(jìn)行偶聯(lián)形成親和載體.其中卵粘蛋白是胰蛋白酶的特異抑制劑，其特異吸附胰蛋白酶后，再通過洗脫，可實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的分離純化.

環(huán)氧氯丙烷活化法簡(jiǎn)便易行［13］，容易操作，毒性低.含有羥基的載體常采用該方法活化.活化時(shí)葡聚糖分子鏈上產(chǎn)生能與卵粘蛋白結(jié)合的活化基團(tuán)，活化過程中葡聚糖還能產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，增加了載體的濾膜截留率［6］.

本研究采用環(huán)氧氯丙烷活化葡聚糖T2000，結(jié)合紅外光譜(IR)和紫外－可見光譜等分析方法，闡述活化過程的相關(guān)機(jī)理.

2.1.1 活化載體的紅外光譜

圖1為葡聚糖T2000與活化的葡聚糖T2000的IR譜圖.活化后的葡聚糖在1272 cm－1和870 cm－1處的吸收峰明顯增強(qiáng)，這2處為環(huán)氧基的特征吸收峰，說明活化葡聚糖中存在環(huán)氧基;此外，在1649cm－1處出現(xiàn)羧酸離子的特征吸收峰.因此活化后的葡聚糖T2000上不僅含有環(huán)氧基，還含有羧基.

圖1 葡聚糖T2000與活化的葡聚糖T2000的IR譜圖Fig.1 IR spectra of dextran T2000 and activated dextran T2000

2.1.2 活化載體的紫外－可見吸收光譜

圖2是葡聚糖 T2000和活化后葡聚糖T2000的紫外－可見(UV-Vis)吸收光譜.從圖2可以看出，葡聚糖的紫外吸收在224nm，其最大吸光值僅為0.16.經(jīng)活化后的葡聚糖的紫外最大吸收變?yōu)?05nm左右的強(qiáng)吸收，最大吸光值達(dá)1.71，這是由于活化的葡聚糖上產(chǎn)生的羧基發(fā)生π→π*躍遷從而表現(xiàn)出的紫外強(qiáng)吸收［12］.環(huán)氧基團(tuán)屬π→σ*躍遷，其吸收波長(zhǎng)小于190 nm，超出紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍，因此在圖2(b)的活化葡聚糖紫外光譜圖上看不到環(huán)氧基團(tuán)的明顯吸收峰.

圖2 葡聚糖T2000與活化的葡聚糖T2000的UV-Vis光譜Fig.2 UV-Vis spectra of dextran T2000 and activated dextran T2000

2.1.3 葡聚糖載體環(huán)氧活化反應(yīng)機(jī)理分析

環(huán)氧氯丙烷具有三元環(huán)結(jié)構(gòu)，以彎曲鍵相互連接，分子中存在一種張力環(huán)，極易與多種試劑反應(yīng)，被用在有機(jī)合成中合成多種化合物;環(huán)氧氯丙烷中氯原子的電負(fù)性很強(qiáng)，誘導(dǎo)效應(yīng)使C—Cl的電子偏向鹵原子，碳上帶有部分正電荷，容易受到帶負(fù)電荷的親和試劑進(jìn)攻;在堿性的條件下，葡聚糖的羥基呈弱酸性，形成負(fù)離子游離基［13］.本研究認(rèn)為負(fù)離子游離基作為親核試劑進(jìn)攻環(huán)氧氯丙烷，由于環(huán)氧氯丙烷中處于三元環(huán)的兩個(gè)碳原子所取的空間結(jié)構(gòu)不同，負(fù)離子親核試劑選擇進(jìn)攻取代基較少的環(huán)碳原子，以減少空間位阻效應(yīng);當(dāng)葡聚糖負(fù)離子游離基進(jìn)攻環(huán)氧氯丙烷時(shí)，環(huán)氧氯丙烷環(huán)上的C—O斷裂，同時(shí)葡聚糖負(fù)離子游離基上的O與環(huán)氧氯丙烷上的C形成C—O，進(jìn)行雙分子親核取代反應(yīng)(SN2)，其反應(yīng)歷程如下:

圖3為SN2反應(yīng)中的勢(shì)能變化示意圖，當(dāng)反應(yīng)物形成過渡態(tài)時(shí)，需要吸收活化能ΔEa=Ea1－Ea2，其中Ea1為過渡態(tài)勢(shì)能最高點(diǎn)，Ea2為反應(yīng)物勢(shì)能.過渡態(tài)為勢(shì)能最高點(diǎn)，即最難達(dá)到的最高能量狀態(tài)，一旦形成過渡態(tài)，即釋放能量，形成產(chǎn)物，反應(yīng)物與產(chǎn)物之間的能量差為ΔH=H1－H2.過渡態(tài)時(shí)親和試劑與環(huán)氧氯丙烷上碳原子的鍵尚未完全形成，但親和試劑上的一對(duì)電子已與碳原子共享，離去基團(tuán)與碳原子之間的鍵尚未完全斷裂，碳原子上的部分負(fù)電荷已轉(zhuǎn)移給離去基團(tuán)［13］.

圖3 Sn2反應(yīng)中的勢(shì)能變化Fig.3 Variation of potential energy in Sn2 reaction

連接有環(huán)氧基團(tuán)的葡聚糖Ⅰ可以與堿性條件下形成的葡聚糖負(fù)離子繼續(xù)反應(yīng)［13］，形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，如反應(yīng)式(3)所示.交聯(lián)分子還可以進(jìn)一步被環(huán)氧氯丙烷活化，形成更大分子的葡聚糖交聯(lián)分子，其反應(yīng)歷程同樣是是雙分子親核取代歷程(SN2).

在活化和交聯(lián)過程中，葡聚糖分子也可被氧化形成羧基，其可能的反應(yīng)為

經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化后的交聯(lián)葡聚糖載體分子上既存在羧基，還存在未發(fā)生交聯(lián)及水解反應(yīng)的環(huán)氧基.環(huán)氧基活潑，不穩(wěn)定，極易化學(xué)分解.為了在偶聯(lián)配基過程中很好地利用環(huán)氧基活性基團(tuán)，活化后的葡聚糖T2000活化載體應(yīng)盡快進(jìn)行親和配基的偶聯(lián)反應(yīng).配基卵粘蛋白含有—NH2，可以與環(huán)氧基和羧基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成水溶性親和載體.

2.2 活化載體偶聯(lián)配基形成的卵粘蛋白親和載體

2.2.1 親和載體的紫外－可見吸收光譜

圖4 親和載體的UV-Vis光譜Fig.4 UV-Vis spectra of affinity escort

圖4是以卵粘蛋白為配基的親和－超濾載體的紫外－可見吸收光譜.在280nm出現(xiàn)明顯的蛋白吸收峰，說明親和載體中含有卵粘蛋白親和配基.

2.2.2 親和載體的紅外光譜

圖5示出了葡聚糖－卵粘蛋白親和載體與葡聚糖的紅外光譜.一個(gè)明顯的特征是葡聚糖－卵粘蛋白親和載體在1514cm－1處出現(xiàn)一個(gè)新峰，為明顯的氨基酸特征吸收，證明親和載體中含有卵粘蛋白，1635cm－1和1514cm－1之間吸收峰明顯增加.在765 ～525 cm－1、2340 cm－1處吸收明顯弱化，甚至消失.這些說明卵粘蛋白在葡聚糖上取代的位置不同，造成有的特征峰消失，有的特征峰加強(qiáng)或新的特征峰出現(xiàn).

圖5 親和載體與葡聚糖T2000的IR譜圖Fig.5 IR spectra of dextran T2000 and affinity escort

2.3 葡聚糖－卵粘蛋白親和載體在胰蛋白酶純化中的應(yīng)用

以胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物系為研究對(duì)象，胰蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為23400，而胰凝乳蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量為22500，由于二者的理化性質(zhì)相似，相對(duì)分子質(zhì)量相近，常規(guī)超濾分離很難將二者彼此分離開.本研究利用卵粘蛋白親和超濾載體選擇性地吸附胰蛋白酶，在親和超濾過程中實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的分離純化.

圖6示出了4℃時(shí)卵粘蛋白親和載體親和吸附胰蛋白酶的吸附等溫線，擬合所得Qm為27.80mg/g(即每克親和載體最大吸附胰蛋白酶量為27.80mg)，解吸平衡常數(shù)Kd為15.10 μg/mL.卵粘蛋白親和載體親和吸附胰蛋白酶的Langmuir吸附等溫方程為

式中:q為胰蛋白酶在親和載體上的吸附量，mg/g;ρ為溶液中胰蛋白酶的濃度，μg/mL.

圖6 親和載體對(duì)胰蛋白酶的吸附等溫線Fig.6 Adsorption isotherm of affinity escort on trypsin

實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)胰蛋白酶的特異吸附及適宜的吸附洗脫條件的選擇，實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的分離純化.經(jīng)親和純化后，胰蛋白酶純化倍數(shù)為45，回收率達(dá)80%.

胰蛋白酶與載體上親和配基的作用是一種復(fù)雜的生物現(xiàn)象，除具備“鎖鑰”關(guān)系外，還需存在特殊的相互作用力，如氫鍵、靜電、疏水等相互作用［14］.此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子發(fā)生親和結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)的分子形態(tài)往往發(fā)生變化，這些因素導(dǎo)致親和作用具有高度的特異性［14］.本實(shí)驗(yàn)利用這種特異性通過親和與超濾的結(jié)合將相對(duì)分子質(zhì)量相近的胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶分離開來.

3 結(jié)語

本研究以胰蛋白酶的特異抑制劑卵粘蛋白為配基，合成了卵粘蛋白－葡聚糖親和超濾載體，分析認(rèn)為，載體環(huán)氧氯丙烷活化反應(yīng)機(jī)理為雙分子的親核反應(yīng)歷程(SN2).以胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物系為對(duì)象，以胰蛋白酶的純化為目標(biāo)，利用合成的親和載體對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行純化，結(jié)果表明，親和載體對(duì)胰蛋白酶的吸附符合Langmuir吸附等溫線方程，純化倍數(shù)為45，活性回收率為80%.對(duì)親和吸附的機(jī)理分析認(rèn)為，由于親和分子對(duì)的鎖鑰關(guān)系及特殊的相互作用力如靜電引力等因素共同作用導(dǎo)致親和作用具用高度的特異性.

［1］ Adamsi-Medda D，Nguyen Q T，Dellacherie E.Biospecific ultrafiltration:a promising purification technique for proteins［J］.Journal of Membrane Science，1981，9(3):337-342.

［2］ Suma Rao，Andrew L Zydney.High resolution protein separations using affinity ultrafiltration with small charged li-gands［J］.Journal of Membrane Science，2006，280(9):781-789.

［3］ Sumana Mukherjee，Debashis Roy，Pinaki Bhattacharya.Comparative performance study of polyethersulfone and polysulfone membranes for trypsin isolation from goat pancreas using affinity ultrafiltration［J］.Separation and Purification Technology，2008，60(3):345-351.

［4］ Kenzo Kanemaru，Tatsuya Oshima，Yoshinari Baba.Selective recovery of histidine-containing dipeptides based on metal affinity interactions using chemically modified dextran in combination with ultrafiltration ［J］.Reactive and Functional Polymers，2010，70(2):103-109.

［5］ Edwie F，Li Yi，Chung T S.Exploration of regeneration and reusability of human serum albumin as a stereoselective ligand for chiral separation in affinity ultrafiltration［J］.Journal of Membrane Science，2010，362(10):501-508.

［6］ 朱家文，曹學(xué)君，武斌，等.水溶性親和超濾載體的制備和應(yīng)用［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，25(6):563-566.Zhu Jia-wen，Cao Xue-jun，Wu Bin，et al.Preparation of dextran-based water soluble macroligand and its application［J］.Journal of East China University of Science and Technology，1999，25(6):563-566.

［7］ Mustafa Teke，Azmi Telefoncu.Purification of bovine pancreatic phospholipase A2 by an affinity ultrafiltration technique［J］.Separation and Purification Technology，2008，63(11):716-720.

［8］ Jonathan Romero，Andrew L Zydney.pH and salt effects on chiral separations using affinity ultrafiltration［J］.Desalination，2002，148(9):159-164.

［9］ Luong J H T，Male K B，Nguyen A L.Synthesis and characterization of a water-soluble affinity polymer for trypsin purification［J］.Biotechnology and Bioengineering，1988，31(5):439-446.

［10］ 方林求，褚楠，薛靜.雞卵清蛋白對(duì)蛋白酶抑制作用的研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，1995，16(6):261-265.Fang Lin-qiu，Chu Nan，Xue Jing.Study on inhibition of proteinase activity by chicken ovalbumin［J］.Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，1995，16(6):261-265.

［11］ 張龍翔.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1997:170-186.

［12］ 彭師奇.藥物的波譜解析［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2002:55-78.

［13］ 岳保珍，李潤(rùn)濤.有機(jī)合成基礎(chǔ)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:15-20.

［14］ 孫彥.生物分離工程［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1998:193.