王臻吳春霞扈玉婷張慧趙彥修

(山東師范大學山東省逆境植物重點實驗室，山東濟南250014)

雷帕霉素靶蛋白(TOR)是存在于真核生物中的一類非常保守的脯氨酸調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族，屬于磷酸肌醇相關(guān)激酶(PIKKs)家族成員［1-2］.20世紀90年代，科學家首先在酵母菌中發(fā)現(xiàn)兩種雷帕霉素的靶蛋白TOR1和TOR2［3］.1994年，Brown等在哺乳動物細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TOR1和TOR2的同源基因，命名為mTOR［4］.酵母TOR激酶分子和mTOR分子均由由5個功能區(qū)域構(gòu)成，從氨基端開始依次為:約20個串聯(lián)的HEAT重復序列、中心區(qū)的FAT域、靠近羧基端的FRB域、激酶域和FATC域［5-7］.

TOR作為一種重要的調(diào)節(jié)基因通過調(diào)節(jié)細胞周期、蛋白質(zhì)合成、細胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能，在細胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調(diào)控點的作用［1-2］.在酵母及哺乳動物細胞中，TOR的調(diào)節(jié)作用主要通過TORC1和TORC2兩組TOR復合物完成.其中，TORC1主要調(diào)控由生長因子、能量、營養(yǎng)、逆境等引起的細胞生長方面的變化，如RNA翻譯、蛋白質(zhì)合成等;TORC2主要對形成細胞骨架的肌動蛋白起調(diào)控作用.

植物的生長和發(fā)育具有很強的可塑性，其形態(tài)及器官會因環(huán)境的變化發(fā)生很大的變化.因此，TOR在植物生長發(fā)育中所起的作用也越來越受到關(guān)注.2002年，法國科學家Menand等［8］在擬南芥中找到了TOR的同源基因，命名為AtTOR(At1g 50030).AtTOR由2 481個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為279000，也含有mTOR和酵母TOR所包含的幾個結(jié)構(gòu)域，其中FRB位于1930－2022，激酶域位于2092－2340，F(xiàn)ATC位于2451－2481［8］.

擬南芥TOR突變體純合子無法完成生活史，在胚胎時期就已致死［8］.在AtTOR完全被敲除掉的純合子中，雖然胚細胞也可進行細胞分裂，但卻不正常，胚無法形成極性的胚軸.不僅如此，純合子在胚乳的發(fā)育上也有缺陷［8］.由此可見，植物的TOR對其生長發(fā)育起著舉足輕重的作用.Deprost等［9］發(fā)現(xiàn)，當擬南芥體內(nèi)的AtTOR表達下調(diào)時，多聚核糖體的積累將大大減少.從這個角度來說，AtTOR在調(diào)控蛋白質(zhì)的合成上，起了一定的作用.

作為一種新型的模式植物，鹽芥具有許多優(yōu)點:個體小，生長周期較短，自花授粉，種子數(shù)目多，基因組也不大［10-12］，僅為擬南芥的兩倍.除此之外，鹽芥對各種非生物脅迫的耐受能力遠遠強于擬南芥.鹽芥cDNA和蛋白的表達與擬南芥的同源性很高，分別為90%和95%［10，13］.本實驗利用分子生物學方法克隆得到鹽芥TOR基因(ThTOR)，并進行了初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

鹽芥(Thellungiella halophila)種子采自山東東營，植株為山東師范大學逆境植物重點實驗室自行種植.

1.1.2 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株為山東師范大學逆境植物重點實驗室保存.

pMD18-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品;pBluescript KS和pCAMBIA3301質(zhì)粒為山東師范大學逆境植物重點實驗室保存，pRT101-INT4為山東師范大學逆境植物重點實驗室孫偉老師改造，用于構(gòu)建RNA干擾(RNAi)框架.

1.1.3 主要培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

LB液體培養(yǎng)基(含相應抗生素)用于培養(yǎng)各種重組菌及DH5α、GV3101等菌株［14］.DH5α的搖床培養(yǎng)條件為37℃、220 r/min;GV3101的搖床培養(yǎng)條件為28℃、220 r/min.

LB固體培養(yǎng)基(含相應抗生素)用于培養(yǎng)重組大腸桿菌和農(nóng)桿菌［14］.DH5α的培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，GV3101的培養(yǎng)條件為28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h.

1.1.4 主要酶及試劑

TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RACE試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司及INVITROGEN公司，其它試劑和藥品為市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 鹽芥總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取鹽芥的新鮮葉片，用Trizol法抽提RNA，分別以3'端引物和Oligo dT18為引物按寶生物工程有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行互補DNA(cDNA)第1條鏈的合成.

1.2.2 鹽芥TOR基因cDNA序列的獲得

表1 克隆ThTOR基因cDNA保守區(qū)所用的兼并引物序列Table 1 Degenerate primer sequences used in the cloning of ThTOR cDNA conservative regions

表2 其它克隆ThTOR基因cDNA所用的引物序列Table 2 Other primer sequences used in the cloning of ThTOR cDNA

依據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中已知的植物TOR家族的蛋白保守區(qū)域，尤其是鹽芥近緣物種擬南芥的基因序列設(shè)計擴增兼并引物(見表1)，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增鹽芥TOR的保守片段.經(jīng)克隆測序后以保守區(qū)序列為模板設(shè)計引物(見表2)，擴增鹽芥TOR的非保守區(qū).通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)獲得鹽芥TOR的兩端序列，3'RACE按照寶生物工程公司試劑盒要求進行，5'RACE按照INVITROGEN公司5'RACE試劑盒進行.兩次RACE的擴增產(chǎn)物測序后，與其它序列拼接后獲得ThTORcDNA的全長序列.

1.2.3 鹽芥TOR基因全長序列的獲得

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取鹽芥新鮮葉片的基因組DNA，根據(jù)已獲得的ThTORcDNA的開放閱讀框(ORF)設(shè)計引物(見表3).使用寶生物工程公司的DNA聚合酶(Pyrobest?DNA Polymerase)，具體方法參照寶生物工程公司說明書.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化后與pBluescript KS載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后進行測序.將所有測序所得序列拼接后獲得鹽芥TOR基因組(ThTOR)的全長序列.

表3 克隆ThTOR基因組所用引物序列Tabal 3 Primer sequences used in the cloning of ThTOR genomic

1.2.4 鹽芥TOR轉(zhuǎn)基因沉默株系的獲得

選擇ThTOR基因FAT域約450 bp的特異性強的序列設(shè)計引物，用于構(gòu)建鹽芥TORRNA干擾沉默載體(ThTOR-RNAi).在引物序列中引入合適的酶切位點，正向引物為5'TGAATTCTTTACCGTTTGATCCAGAAGTATCAC3'，反向引物為5'ATATCCCGGGACTGCAGAAACAACG3'.以pRT101-INT4載體為中間載體構(gòu)建RNAi表達框架(見圖1)，成功后，再用合適的酶克隆到植物表達載體pCAMBIA3301上.構(gòu)建成功的ThTOR-RNAi植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽性克隆，利用花浸染法轉(zhuǎn)化鹽芥.

圖1 ThTOR-RNAi框架Fig.1 Frame of the ThTOR-RNAi

T0幼苗出苗2～3周后，用0.1%(體積分數(shù))的Basta噴灑篩選，轉(zhuǎn)基因植株由于具有除草劑抗性得以存活.用改良CTAB法提取抗性植株的葉片總DNA，以ThTOR基因沉默表達載體DNA為陽性對照，野生型植株和無菌雙蒸水為陰性對照，對基因沉默的目的片段進行PCR檢測.PCR檢測陽性的抗性植株為轉(zhuǎn)基因株系.

1.2.5 鹽芥TOR轉(zhuǎn)基因沉默株系的性狀分析

將轉(zhuǎn)基因株系用實時定量PCR的方法進一步確定ThTOR在沉默株系中的表達量.根據(jù)ThTOR的cDNA全長序列設(shè)計特異正向引物5'TCAATGAAGTCCCTCAATTAGCCTTGCTTG3'和反向引物5'CCAAGCATATTCACAGCCTGAAGAATTTCC3'.分析中選用表達相對穩(wěn)定的鹽芥肌動蛋白7的基因(actin7)作為內(nèi)標基因.根據(jù)基因的保守序列(從山東師范大學逆境植物重點實驗室鹽芥cDNA文庫獲得)設(shè)計正向引物5'AAATACAGTGTCTGGATCGGAGGATCTATC3'和反向引物5'TAACAAACTCACCACCACGAACAAGAGAAG3'.

本實驗采用的實時定量PCR方法是相對定量方法，是使用內(nèi)源性的對照來校正樣品的加樣量，通過與對照樣品相比較計算未知樣品的量.PCR反應中，在其它參數(shù)恒定的反應條件下，產(chǎn)物開始進入指數(shù)期增長的循環(huán)數(shù)(CT)只與反應體系中原始模板的量有關(guān)，通過2－ΔΔCT計算將統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式.其中ΔCT表示目標基因和內(nèi)標基因CT值的差異，ΔΔCT表示糾正過加樣誤差后不同處理株系與對照株系目標基因CT值的差異，2－ΔΔCT則表示不同處理株系與對照株系目標基因表達的相對變化.根據(jù)定義，對照株系中目標基因的表達量為1，而相對于對照株系，處理株系中目標基因表達的倍數(shù)為2－ΔΔCT.

根據(jù)檢測結(jié)果，選用ThTOR基因表達量下調(diào)的株系.將野生型鹽芥種子與轉(zhuǎn)基因鹽芥種子同時用水浸泡于4℃2～3周，取出均勻播種于培養(yǎng)土(育苗介質(zhì)、蛭石、珍珠巖體積比為4∶3∶1)中，溫度為18～22℃，16h光照，8h黑暗.植株生長至有4－6片真葉時，將其移入裝滿培養(yǎng)土直徑約7 cm的小盆中.

2 結(jié)果與分析

2.1 ThTOR cDNA全長的克隆與分析

以鹽芥cDNA為模板，分別用保守區(qū)兼并引物及非保守區(qū)引物(如表1、2所示)進行PCR反應，將PCR產(chǎn)物回收克隆后進行測序，通過序列拼接獲得含有一個完整編碼區(qū)的基因序列，命名為ThTOR，Genbank登錄號為HQ420260.所獲得的ThTOR基因的cDNA全長7836bp，ORF為7437 bp，5'非編碼區(qū)為196bp，3'非編碼區(qū)為203 bp，與擬南芥TORcDNA的同源性高于95%.全序列的第197－199個堿基編碼起始密碼子M，7634－7636處的TGA為終止密碼子，編碼2 479個氨基酸，相對分子質(zhì)量為279000.

2.2 ThTOR基因組全長的克隆與分析

以鹽芥基因組DNA為模板，用表3中的引物進行PCR擴增，得到的特異條帶經(jīng)測序后拼接得到ThTOR基因組序列全長.ThTOR基因組DNA長度為19162bp，其中有55段內(nèi)含子和56段外顯子，Genbank登錄號為HQ420259.擬南芥AtTOR基因組DNA長度為17555 bp，比鹽芥少了約2 kbp，但其外顯子片段個數(shù)與鹽芥相同.鹽芥與擬南芥外顯子在DNA序列中的位置比較如表4所示.由表4可以看出，內(nèi)含子及外顯子的分布在擬南芥及鹽芥中都較為均勻，沒有較大差異.

2.3 ThTOR推導的蛋白序列的分析

ThTOR蛋白序列由2 479個氨基酸組成，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，ThTOR與AtTOR的蛋白序列僅有63個氨基酸發(fā)生變化，同源性高達97.5%.表5示出了ThTOR與AtTOR中差異氨基酸的位置及其突變類型.ThTOR具有TOR基本的結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)AT域位于第1309－1887個氨基酸;FRB域位于第1920－2023個氨基酸;激酶域位于第2 090－2 340個氨基酸;FATC位于第2447－2479個氨基酸.

表4 鹽芥ThTOR與擬南芥AtTOR外顯子位置的比較Table 4 Exon location comparison between ThTOR and AtTOR

2.4 ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因株系的獲得與鑒定

2.4.1 鹽芥ThTOR-RNAi植物表達載體的構(gòu)建

由PCR獲得用于RNAi的ThTOR基因片段(約450bp)，測序后與已獲得的ThTORcDNA進行比對，結(jié)果完全一致.

將構(gòu)建好的ThTOR-RNAi表達框架克隆入植物表達載體，重組質(zhì)粒命名為3301-THCM.

2.4.2 鹽芥ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

提取Basta初步篩選的抗性植株的DNA，用PCR方法對ThTOR基因的RNAi片段進行檢測，檢測結(jié)果為陽性即證明抗性植株中已成功轉(zhuǎn)入RNAi表達框架，PCR檢測結(jié)果見圖2.水陰性對照及野生型鹽芥中均未擴增出ThTOR-RNAi片段，而轉(zhuǎn)基因植株中均擴增出與陽性對照大小一致的片段.

表5 ThTOR與AtTOR差異氨基酸的比較Fig.5 Comparison of differentamino acids between ThTOR and AtTOR

圖2 部分轉(zhuǎn)基因株系的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of some transgenic plants

2.5 鹽芥ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因株系ThTOR基因的表達及表型分析

圖3 ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生長情況Fig.3 Growth of wild type and the ThTOR-RNAi transgenic plants

圖4 ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株果莢的生長情況Fig.4 Infruit development of wild type and the ThTOR-RNAi transgenic plants

2.5.1 鹽芥ThTOR-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中ThTOR基因的表達分析

本實驗把野生型鹽芥(wt)作為對照樣品(本研究中所有檢測及照片涉及到的野生型均為同一株系).通過實時定量PCR，共對3個轉(zhuǎn)基因沉默株系ThI1、ThI5、ThI6的mRNA表達水平進行了分析.野生型和轉(zhuǎn)基因株系ThI1、ThI5、ThI6的2－ΔΔCT值分別為1、0.8060、0.5873、0.7457.可見，3個轉(zhuǎn)基因沉默株系的ThTOR表達水平均有不同程度的降低.其中，ThI5和ThI6降低更為顯著.

2.5.2ThTOR對鹽芥的生長及果莢發(fā)育的影響

根據(jù)實時定量PCR的分析結(jié)果，選取ThTOR下調(diào)明顯的ThI5和ThI6與生長發(fā)育時間一致的同一株野生型鹽芥相比，見圖3、4.由圖3可知，ThTOR基因沉默株系的生長明顯緩慢，野生型鹽芥種子已處于成熟狀態(tài)，而轉(zhuǎn)基因沉默株系僅處于抽苔前期.由圖4可知，ThI5和ThI6這兩個株系的鹽芥植株的果莢有明顯敗育現(xiàn)象.跟野生型相比，ThTOR基因沉默鹽芥春化開花后，無法正常形成果莢，或形成的果莢發(fā)育不全，不飽滿，種子數(shù)量也遠遠小于野生型.

3 結(jié)論

AtTOR和ThTOR的蛋白序列同源性很高，達97.5%，cDNA序列的同源性也高于95%.結(jié)果表明，盡管ThTOR的基因組序列比AtTOR的基因組序列多了近2 kbp，但兩個物種的內(nèi)含子及外顯子分布都較為均勻，沒有明顯的差異.ThTOR基因沉默株系具有明顯的生長遲緩和敗育的現(xiàn)象.說明ThTOR

對鹽芥的生長發(fā)育，尤其是鹽芥的生殖器官，起重要作用.這一現(xiàn)象與擬南芥的研究結(jié)果相一致.

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