劉曉娟 張力青 李 健 翟方麗 李慎濤，2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系; 3.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院華信醫(yī)院檢驗(yàn)科)

1997年，Ji H等［1］通過cDNA直接差異測序法(direct-differential cDNA sequencing)分析克隆發(fā)現(xiàn)了一種新的基因——乳腺癌特異性基因1(breast cancer-specific gene 1，bcsg1)。該基因在乳腺癌cDNA文庫中高表達(dá)，而在正常乳腺中幾乎不表達(dá)［1］。它與神經(jīng)蛋白突觸核蛋白家族成員具有高度的同源性，其后證實(shí)它與從腦基因文庫和cDNA文庫分離的γ-突觸核蛋白基因及persyn是同一基因，是突觸核蛋白家族的第3個成員［2］。突觸核蛋白是一個廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前成分內(nèi)的小分子可溶性蛋白質(zhì)家族，由α-突觸核蛋白(SNCA)、β-突觸核蛋白(SNCB)和γ-突觸核蛋白(SNCG)3個成員組成，是一組氨基酸序列及結(jié)構(gòu)高度同源的天然伸展蛋白。目前，對于它們的生物學(xué)功能還未充分了解，有研究［3］表明它們與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及某些神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

γ-突觸核蛋白的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，包括女性激素敏感性乳腺癌、卵巢癌，男性激素敏感性前列腺癌，消化系統(tǒng)腫瘤如食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌，以及肺癌、膀胱癌等［4－5］。雖然γ-突觸核蛋白在各種腫瘤中的陽性率不同，但它們有個共同特點(diǎn)，除食管癌外，γ-突觸核蛋白表達(dá)水平具有明顯的期別相關(guān)性特征，即隨病期進(jìn)展，其表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度漸增［6］。

人γ-突觸核蛋白與小鼠和大鼠γ-突觸核蛋白的一致性分別為87.7%和83.8%，與α-突觸核蛋白、β-突觸核蛋白和 synoretin的一致性分別為54%、56%和84%［7］。突觸核蛋白家族序列具有高度相似性，都由一個氨基端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域、一段11個殘基的重復(fù)序列和一個酸性羧基末端組成［8］。氨基末端高度保守，在羧基末端，γ-突觸核蛋白與α、β-突觸核蛋白不同，缺乏2個16個殘基的串聯(lián)重復(fù)序列，僅保留了其強(qiáng)酸性的特點(diǎn)。高度保守的氨基端在脂質(zhì)相互作用中起重要作用，強(qiáng)酸性的羧基末端具有類似分子伴侶活性的作用，介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。突觸核蛋白蛋白家族各成員結(jié)構(gòu)的差異也將引起彼此間功能的差異，繼而導(dǎo)致其在各種疾病中的不同作用［9］。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人腦cDNA文庫由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊茂君教授惠贈;原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株DH5α及表達(dá)菌株BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存; DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司;DNA片段膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司;Glutathione SepharoseTM4B購自Amersham公司;Sephadex G25、Superdex 75 Hiload 16/ 60和Resource Q預(yù)裝柱購自GE公司。引物合成及DNA測序由上海生工公司完成，Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，二硫基蘇糖醇(DTT)，異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)均購自Sigma公司;胰蛋白胨和酵母提取物(LB)購自O(shè)xoid公司;其他常用化學(xué)試劑均為分析純，購自北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司。

制冷恒溫?fù)u床(Thermo公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-2D);電泳儀(BIO-RAD，PowerPac3000);高速離心機(jī)(BECKMAN J2-HS);凝膠成像處理系統(tǒng)(GE healthcare ImageQuant 300);AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)(GE公司);MALDI-TOF質(zhì)譜儀(PE公司)。

1.2 方法

1)目的基因片段的擴(kuò)增:根據(jù)GenBank報(bào)道的γ-突觸核蛋白(NM_003087)序列，設(shè)計(jì)特異性引物，分別添加BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。以人cDNA文庫為模板，PCR擴(kuò)增γ-突觸核蛋白的編碼序列。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2)克隆及鑒定:將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用BamHI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的載體pGEX-6p-1按5:1摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α，涂布到含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過夜，次日，從LB平板上隨機(jī)挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒再進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序。

3)誘導(dǎo)表達(dá)分析:用測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，隨機(jī)挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜，次日，按1∶100的比例將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h，5 000 r/ min離心15 min收集菌體，取適量菌體用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

4)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)形式分析:分別對在不同溫度、不同IPTG終濃度、培養(yǎng)液的不同OD600值及不同表達(dá)時(shí)間4種條件下誘導(dǎo)后的菌體取樣進(jìn)行SDS-PAGE，確定目標(biāo)蛋白的最佳表達(dá)條件。在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，4 000 r/min離心15 min收集菌體，用 PBS(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.8 mmol/ L KH2PO4)重懸菌體，4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶(終濃度至1 mg/ mL)、DTT及PMSF(終濃度至1 mmol/L)，冰上作用30 min后，在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000 r/ min離心50 min，上清和沉淀分別取樣進(jìn)行 SDSPAGE，確定目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式。

5)γ-突觸核蛋白重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將γ-突觸核蛋白工程菌接種于40 mL含氨芐青霉素(100 μg/ mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日，按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接于1 L含氨芐青霉素(100 μg/ mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液OD600值達(dá)到0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度0.4 mmol/ L)，于30℃下誘導(dǎo)表達(dá)11 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體用于目標(biāo)蛋白的純化。

6)γ-突觸核蛋白的純化:將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用超聲波破菌，離心收集上清，加到已用PBS平衡的Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱上，讓其自然通過柱，然后用PBS洗滌雜蛋白，用酶切緩沖液(25 mmol/ L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 7.5)平衡柱，加入200 μL(1 mg/mL)PreScission蛋白酶，于4℃酶切過夜。次日，用洗脫緩沖液(25 mmol/L Tris-HCL、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 7.5)洗脫，收集穿過的蛋白樣品，用15%的SDS-PAGE鑒定。

收集蛋白，用Sepherdex G25柱脫鹽，緩沖液用陰離子交換A液(25 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)，隨后將脫鹽后的蛋白樣品過Resource Q陰離子交換柱，所用緩沖液為:A液(25 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)、B液(25 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)。收集含有蛋白質(zhì)的組分，用 SDSPAGE鑒定，將含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的組分合并，用濃縮管濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積，加至Superdex 75 Hiload 16/60柱上，進(jìn)行凝膠過濾純化，所用緩沖液為凝膠過濾緩沖液(25 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)。利用AKTA純化儀隨機(jī)軟件對洗脫峰進(jìn)行積分并估算蛋白質(zhì)濃度。

7)目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜分析:從SDS-PAGE膠上切取含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的膠點(diǎn)，經(jīng)還原烷基化消化后，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)分析。運(yùn)用Mascot軟件對PMF的結(jié)果與NCBI中的蛋白質(zhì)庫的理論圖譜進(jìn)行比較和評價(jià)，得出蛋白質(zhì)的可能性分?jǐn)?shù)，根據(jù)所用蛋白數(shù)據(jù)庫來確定陽性的分?jǐn)?shù)，從而判定是否為γ-突觸核蛋白。

2 結(jié)果

2.1 γ-突觸核蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到了編碼γ-突觸核蛋白的DNA片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小與預(yù)期的一致。將該片段和pGEX-6p-1載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定得到陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定，得到陽性克隆，測序結(jié)果證實(shí)為γ-突觸核蛋白編碼序列。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)分析

γ-突觸核蛋白工程菌在37℃、1 mmol/L IPTG的條件下誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h，在破菌沉淀中可見相對分子質(zhì)量約為39 000的特異性蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，大小與預(yù)期的一致。

2.3 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

1)在培養(yǎng)液 OD600值等于0.8、IPTG濃度0.5 mmol/L條件下，分別在16℃、23℃、30℃及37℃誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后7 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明30℃時(shí)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖1)。

圖1 目標(biāo)蛋白在不同溫度下誘導(dǎo)后的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG at different temperature1：before induction;2：16℃;3：23℃;4：30℃;5：37℃;M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000;IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

2)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、30℃條件下，用終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后7 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明當(dāng)IPTG終濃度為0.4 mmol/L時(shí)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖2)。

圖2 目標(biāo)蛋白在不同濃度IPTG誘導(dǎo)后的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE analysis of target protein induced with different final concentration of IPTG1：before induction;2：0.1 mmol/L IPTG;3：0.2 mmol/L IPTG;4：0.3 mmol/L IPTG;5：0.4 mmol/L IPTG;6：0.5 mmol/L IPTG;7：0.6 mmol/L IPTG;8：0.7 mmol/L IPTG; M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000，16 000; IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

3)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、30℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L條件下誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明誘導(dǎo)后11 h目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖3)。

4)在IPTG終濃度為0.4 mmol/L、30℃誘導(dǎo)條件下，在培養(yǎng)液OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時(shí)誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白，于誘導(dǎo)后7 h取樣SDSPAGE，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)液OD600值為0.8時(shí)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量最大(圖4)。

圖3 目標(biāo)蛋白在誘導(dǎo)后不同時(shí)間的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG for different time1：Before induction;2：1 h;3：3 h;4：5 h;5：7 h;6：9 h; 7：11 h;8：13 h;M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000，16 000;IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

由上述實(shí)驗(yàn)可知，γ-突觸核蛋白在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件為:培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)液OD600值等于0.8、IPTG終濃度0.4 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間11 h。

2.4 蛋白表達(dá)形式分析

在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)菌體表達(dá)目標(biāo)蛋白后，用超聲完全裂解菌體，SDS-PAGE表明，上清中含有大量目標(biāo)蛋白，說明γ-突觸核蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)。

2.5 蛋白純化

將收集的菌體破碎、離心后，收集上清，進(jìn)行Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化，得到較高純度的目的蛋白。利用陰離子交換進(jìn)一步純化目標(biāo)蛋白，收集主峰各組分。合并后經(jīng)電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖5)。將含有目標(biāo)蛋白的組分合并，用濃縮管濃縮至0.5 mL，再用分子篩層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到純度較好的目標(biāo)蛋白(圖6)。

圖6 分子篩純化圖及SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 Purification profile of human synuclein gamma by Superdex 75 column and analysis by SDS-PAGEA：Purification profile on Superdex 75 Hiload 16/60;B：SDS-PAGE;1：fraction A3 of gel filtration; 2：fraction A4 of gel filtration;M：116 000，66 200，45 000，25 000，18 400，14 400.

2.6 蛋白的質(zhì)譜鑒定

將樣品SDS-PAGE膠點(diǎn)消化后，進(jìn)行質(zhì)譜分析表明，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索，該蛋白與蛋白質(zhì)庫中γ-突觸核蛋白的可能性分值為90。從蛋白水平證實(shí)該蛋白為γ-突觸核蛋白(圖7)。

3 討論

圖7 蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.7 The result of mass spectrography

γ-突觸核蛋白作為一種全新的基因，因其獨(dú)特的表達(dá)特點(diǎn)和病理機(jī)制正受到越來越多的關(guān)注。它在神經(jīng)退行性疾病、視覺組織、嗅覺組織的一些病理狀態(tài)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起作用。γ-突觸核蛋白是一種提示腫瘤惡性表型和不良預(yù)后的分子標(biāo)志物，在腫瘤分期、早期診斷、治療中有重要作用。隨著對該基因研究的逐步深入，它有可能成為某些腫瘤治療的全新分子靶點(diǎn)，指導(dǎo)設(shè)計(jì)最優(yōu)化和個性化的治療方案，開發(fā)新藥，逆轉(zhuǎn)腫瘤惡化，改善預(yù)后，為腫瘤的攻克提供一個新的方向。但對其的研究工作僅得到一些初步結(jié)果，其在各種疾病中的功能仍需進(jìn)一步探究。

本研究已成功地在大腸桿菌中表達(dá)了γ-突觸核蛋白，并建立了純化工藝，目前正在進(jìn)行γ-突觸核蛋白的晶體學(xué)及功能研究，試圖從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度闡明γ-突觸核蛋白的功能。

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