張宏偉 吳 昊

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科)

負調(diào)控因子(negative factor，Nef)作為人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)附屬蛋白之一，其基因在靈長類慢病毒，即HIV-1，HIV-2和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)中高度保守，表達于病毒生活周期的早期。早期研究［1－3］表明，該基因的蛋白產(chǎn)物對病毒復(fù)制具有抑制作用，因而得名為“負性因子”或Nef。但隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)，Nef能夠增強病毒的復(fù)制能力和感染性，促進艾滋病病情的進展［4－5］。本文對于Nef的結(jié)構(gòu)特點及生物學作用進行綜述如下。

1 Nef蛋白的結(jié)構(gòu)特點

HIV Nef蛋白是相對分子質(zhì)量為25 000～34 000的豆蔻?；鞍?，存在于細胞質(zhì)和細胞膜上［6］。目前尚未發(fā)現(xiàn)Nef蛋白具有酶活性。大量研究［7－9］顯示，Nef具有一些保守模體，這些模體可與細胞因子發(fā)生相互作用。因而，Nef具有銜接蛋白的功能，通過蛋白-蛋白之間的多重相互作用調(diào)節(jié)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Nef的柔韌性相對較大，具有較大的溶劑暴露面和一些無序區(qū)。正是由于這些特點，很難獲得Nef蛋白全長序列的精確三維結(jié)構(gòu)。然而，采用X線晶體學以及磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)的方法，Nef的球形核心結(jié)構(gòu)域(第54～205位氨基酸殘基)已經(jīng)被成功解構(gòu)［10－11］，此外，運用NMR光譜分析技術(shù)，Geyer M等［7］又成功解析Nef蛋白氨基端錨定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，除氨基端豆蔻酰化基團外，部分空間排列有序。基于這些構(gòu)象解析，Geyer M等［12］設(shè)計出一種預(yù)測Nef蛋白全長序列的構(gòu)象的模型。在此模型中，Nef表面由許多線性排列的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域組成，因此，具有較大的彈性。Nef的柔性使該蛋白能夠在多種構(gòu)象間進行轉(zhuǎn)換，其構(gòu)象依其所結(jié)合的對象而定。

2 Nef的生物活性

2.1 Nef對主要組織相容性復(fù)合體I(major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)功能的影響

在1989年，兩項研究［13－14］先后報道了在HIV感染的T細胞中MHCⅠ下調(diào)的現(xiàn)象。7年后，Schwartz O及其同事［15］發(fā)現(xiàn)，HIV-1 Nef是引起這一效應(yīng)的附屬蛋白。突變研究［8］顯示，破壞Nef的含有蛋氨酸殘基(R17ERM20RRAEPA26)的兩親性 α-螺旋、酸性區(qū)(E62-65)或多聚脯氨酸螺旋(P69/72/75/78)可降低它在MHCⅠ轉(zhuǎn)運方面的活性，阻斷Nef與MHCⅠ細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。

HIV Nef降低MHC-Ⅰ中人類白細胞抗原A、B (human leukocyte antigens-A、B，HLA-A、HLA-B)在感染細胞表面的表達，從而減少病毒抗原在HIV感染細胞表面的暴露，避免HIV感染的細胞被HIV特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的識別和殺傷［16］。HIV Nef不影響HLA-C和HLA-E的表達［17］。這些分子向自然殺傷(natural killer cell，NK)細胞提供適當?shù)囊种菩盘?，以逃逸NK細胞的殺傷。因此，Nef可在適應(yīng)性和先天性細胞免疫兩個方面保護HIV感染的細胞。

2.2 Nef對CD4的影響

CD4蛋白是HIV感染的輔助受體。由于細胞膜上存在的CD4可降低新生病毒顆粒出芽和離開感染細胞的能力，減少病毒的感染性，因此，HIV感染細胞后，細胞表面的CD4對病毒具有不利影響。HIV-1通過兩種蛋白即Vpu和Nef對抗這一效應(yīng)［18］。目前認為，Nef對于CD4向細胞表面的轉(zhuǎn)運無顯著影響，但可明顯縮短細胞表面CD4分子的半衰期。

Nef的這一功能可能是通過與CD4細胞質(zhì)尾部結(jié)合而實現(xiàn)的。NMR結(jié)構(gòu)分析表明［9］，Nef核心結(jié)構(gòu)域的疏水袋與CD4胞質(zhì)尾部的13個氨基酸肽段(QIKRLLSEKKT)具有直接的相互作用。這一相互作用在體外相當弱(解離常數(shù)為1 mmol/L)，但十分特異，因為肽段中雙亮氨酸膜體的斷裂可以破壞這種作用［9］。有研究［19］表明，全長Nef與CD4細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域形成的復(fù)合體更加穩(wěn)定，解離常數(shù)約為0.5 mmol/L，由此提示，Nef蛋白氨基端其他的氨基酸也參與了與CD4的相互作用。然而，體內(nèi)檢測到Nef與CD4的相互作用并不需要雙亮氨酸模體的參與，可能還有其他因素參與這種相互作用［20］。

Nef羧基端彈性袢中有3個結(jié)構(gòu)域與Nef下調(diào)CD4的能力有關(guān)，即雙亮氨酸模體(EXXXLL165)和2個酸性模體(EE155和DD175)。雙亮氨酸模體和雙天門冬氨酸模體的作用已經(jīng)明確，其中之一發(fā)生突變可完全破壞Nef的活性。

2.3 Nef介導(dǎo)的CD28下調(diào)

T細胞受體(T cell receptor，TCR)功能的發(fā)揮需要輔助分子如CD28所傳遞的輔助刺激信號。研究［21］表明，TCR或CD28與配體單獨結(jié)合僅能激活少量T細胞，造成一種無能狀態(tài)。除下調(diào)CD4以外，Nef也能夠加速輔助刺激分子CD28的內(nèi)化?；蚝凸δ苎芯浚?2］顯示，Nef介導(dǎo)的CD28內(nèi)吞作用需要銜接蛋白2(adaptor protein 2，AP2)參與，由Nef，AP2和CD28直接相互作用所引起，Nef的這一作用是一種保守現(xiàn)象。Nef的LL165/166和His194殘基對于下調(diào)CD28具有關(guān)鍵作用。

CD28分子下調(diào)對于病毒的益處尚不明確，一種假說［22］認為，通過下調(diào)CD28，病毒能夠阻止T細胞激活。CD28和B7分子之間、TCR/CD4和MHCⅡ類分子之間的相互作用對于穩(wěn)定和維持T細胞與抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APCs)間緊密而又持久的相互作用，具有十分重要的意義。Nef介導(dǎo)的C28和CD4下調(diào)可減弱T細胞與APC細胞之間的相互作用促進，感染的T細胞進入血液循環(huán)，以及向其他APC細胞運動，從而增強病毒的傳播［22］。此外，通過下調(diào)CD28，Nef可降低感染T細胞和APC之間的信號傳導(dǎo)或干擾正常的TCR啟動信號。此效應(yīng)對于阻斷激活誘導(dǎo)的凋亡十分重要。由于Nef可激活特定的下游效因子如活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)，替代正常信號級聯(lián)反應(yīng)［22］，因而，盡管CD28被異常下調(diào)，但感染的細胞仍能維持于激活狀態(tài)，導(dǎo)致T細胞激活與抗原提呈脫節(jié)。

2.4 Nef介導(dǎo)的MHCⅡ類分子下調(diào)

MHCⅡ蛋白表達于所有抗原提呈細胞中，發(fā)揮向CD4+T細胞提呈抗原肽的作用。在慢性感染的單核細胞中，MHCⅡ抗原提呈受到阻礙，HIV-1 Nef可影響MHCⅡ蛋白在細胞表面的定位，減少外源性肽段向CD4+細胞的提呈［23］。

Nef蛋白通過兩種機制破壞MHCⅡ抗原提呈，其中包括下調(diào)成熟MHCⅡ在細胞表面的表達以及上調(diào)MHCⅡ相關(guān)的恒定鏈(invariant chain，Ii)在細胞表面的表達。與Ii的上調(diào)相比，成熟MHCⅡ的下調(diào)所需Nef的濃度較高［23］。雙亮氨酸模體(LL165/166)和酸性模體(EDE174～176)對于Nef誘導(dǎo)的CD4下調(diào)和Ii上調(diào)十分關(guān)鍵，75和78位脯氨酸突變可阻斷MHCⅠ和MHCⅡ下調(diào)，但對于Ii上調(diào)沒有影響［24］。這些結(jié)果揭示Nef下調(diào)MHCⅡ的詳細機制，這一功能在抑制病毒特異性T細胞免疫方面具有重要作用。

2.5 Nef對病毒感染性和復(fù)制能力的影響

研究［24］顯示，采用HeLa-CD4-LTR-β-半乳糖苷酶標志的細胞系感染試驗中，Nef+HIV-1比Nef-HIV-1感染的細胞多5～20倍;在單輪感染試驗中，Nef突變的原病毒DNA生產(chǎn)的病毒顆粒的感染性比野生型病毒株降低4～40倍。Nef缺陷株的傳染性可通過在產(chǎn)生病毒的細胞中加入表達Nef的質(zhì)粒而得以加強。

Nef可通過增加宿主淋巴細胞數(shù)量而促進病毒復(fù)制。NFAT是一種在協(xié)調(diào)T細胞激活方面發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)Manninen A等［25］報道，Nef可誘導(dǎo)產(chǎn)生NFAT的生成，Nef對于T細胞的這種作用為鈣/鈣神經(jīng)素通路所調(diào)節(jié)，并與Ras通路相協(xié)同。在靜止的CD4+T淋巴細胞中，NFAT的異常表達可誘導(dǎo)出一種容許狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，盡管缺少有關(guān)T細胞激活方面的證據(jù)，但HIV仍然可以在這些細胞中復(fù)制。

發(fā)動蛋白2對于Nef增加病毒感染性是必需的。據(jù)Massimo A等［26］報道，采用RNA干擾技術(shù)敲除發(fā)動蛋白2后可抑制Nef增加病毒感染性的能力。對于發(fā)動蛋白2敲除的細胞，外源性表達發(fā)動蛋白2可補救Nef的這一功能。Nef誘導(dǎo)的病毒感染性增加尚依賴于包涵素，因為在包涵素敲除的細胞或表達AP18的細胞中，Nef的這一功能明顯降低，甚至完全受到抑制。

2.6 Nef對細胞凋亡的影響

Nef可誘導(dǎo)感染的和未感染的免疫效應(yīng)細胞發(fā)生凋亡。在感染的細胞中，Nef誘導(dǎo)HIV特異性細胞毒性T細胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)自殺相關(guān)因子(factor associated suicide，F(xiàn)as，CD95)和 Fas配體(CD95L)的表達，凋亡信號的激活導(dǎo)致HIV特異性CTL凋亡，從而出現(xiàn)免疫逃逸。Nef可通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和核因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)凋亡，氨基末端豆蔻?；茐幕騌106A突變后，Nef喪失誘導(dǎo)凋亡的能力［27］。

Nef可增強宿主細胞耐受Fas和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α介導(dǎo)的凋亡，改變病毒感染細胞的胞內(nèi)微環(huán)境。HIV病毒可使感染T細胞表面FasL表達增加［28］，促進鄰近的CTL凋亡，從而保護感染的細胞。為了阻止FasL和TNF-α誘導(dǎo)感染的細胞發(fā)生未成熟死亡，Nef與細胞內(nèi)凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signal-regulating kinase，ASK1)結(jié)合，從而抑制Fas介導(dǎo)的細胞凋亡，保護感染細胞免于凋亡。

Nef也可通過Bad抑制死亡信號傳導(dǎo)，Bad是B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)蛋白家族中促凋亡成員之一，其表達受HIV誘導(dǎo)，在線粒體水平調(diào)控細胞凋亡［29］。Nef介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和p21活化蛋白激酶(p21-activated protein kinases，PAK)激活可導(dǎo)致Bad磷酸化，引起抗凋亡蛋白Bcl-XL從Bad/Bcl-XL復(fù)合體中釋放出來，增加細胞的存活和病毒的復(fù)制［29］。

此外，Nef也可通過氨基末端(1～57位氨基酸殘基)直接結(jié)合腫瘤抑制因子P53，降低P53蛋白的半衰期、DNA結(jié)合能力及轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制HIV-1感染的細胞發(fā)生P53介導(dǎo)的細胞凋亡。具體機制可能是通過激活P21激活的激酶和PI3K而阻止細胞凋亡通路。

3 結(jié)論

Nef作為HIV附屬蛋白之一，是相對分子質(zhì)量較小的豆蔻酰化蛋白，Nef的柔韌性相對較大，具有一些保守模體，這些模體是Nef發(fā)揮多種功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

Nef蛋白通過下調(diào) CD4，MHCⅠ，MHCⅡ和CD28分子的表達，在對抗宿主免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用。Nef在T細胞中可啟動轉(zhuǎn)錄，增強病毒的復(fù)制和感染性。Nef蛋白也通過抑制外源性和內(nèi)源性死亡信號而促進感染細胞的存活。

在感染的細胞中Nef作為銜接蛋白募集信號傳導(dǎo)復(fù)合體，在HIV致病機制方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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