宮昌海 ，王惠娥 ，高慶華 ，唐繼偉

（1.新疆巴州畜牧工作站，庫爾勒 841000；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300）

牛、梅花鹿和山羊X、Y精子頭部面積差異分析

宮昌海1，王惠娥2，3，高慶華2，3，唐繼偉3

（1.新疆巴州畜牧工作站，庫爾勒 841000；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300）

用流式細胞儀分選有正常繁殖力的公牛（n=3）、公鹿（n=3）、公山羊（n=1）的精液，獲得高純度（≥91%）X和Y細管冷凍精液，對解凍后的X和Y精子進行常規(guī)染色制片，采用Motic Images Advanced 3.2軟件自動測量X精子和Y精子頭部面積。結(jié)果顯示，公牛X精子的頭部面積35.84 μm2±4.12 μm2，極顯著高于Y精子（34.81 μm2±3.72 μm2）（P＜0.01）；梅花鹿 X 精子的頭部面積 33.29 μm2±2.93 μm2，極顯著高于 Y 精子（32.90 μm2±3.25 μm2）（P＜0.01）；山羊 X 精子的頭部面積 28.53 μm2±3.16 μm2，也極顯著高于 Y 精子（28.07 μm2±3.19 μm2）（P＜0.01）；不同分選純度的公牛精液X精子之間、Y精子之間頭部面積差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：牛、梅花鹿、山羊X精子頭部面積均極顯著高于Y精子。

牛；公梅花鹿；公山羊；精子；流式細胞儀；頭部面積

哺乳動物X、Y精子的差別是X、Y精子分離的基礎(chǔ)，根據(jù)兩性精子DNA含量的差異流式分選是當前的主流技術(shù)，且這個技術(shù)的正確性在牛上已經(jīng)被大量生產(chǎn)預(yù)知性別的后代所證明［1-3］。流式細胞檢索儀可以高速分離精子，但需要對精子細胞核染色和強激光照射，會對精子DNA產(chǎn)生一定損傷［4-5］，盡管有牛分離精子的正常后代可以繼續(xù)正常繁殖下一代的報道［6-8］，但還是不能得出該技術(shù)是完全安全的評價。若這個技術(shù)應(yīng)用到人類，安全性將是主要的限制，畢竟此項技術(shù)用于動物生產(chǎn)還不到20年。而人類醫(yī)學(xué)實踐中多應(yīng)用X、Y精子的比重差異，通過密度梯度離心分離有限純度的兩性精子［9-11］。精子頭部外形差異是一個重要特征，除了嚙齒類等一些哺乳動物的精子頭部呈圓形或三角形，大部分哺乳動物有一個扁平、卵形的頭部，同卵子相比，哺乳動物精子細胞小得多，頭部長度僅為 5～10 μm［12］。流式細胞儀獲得的兩個主信號——前向散射光（forward，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射光（side scatter，SSC），也可以用來分析細胞的大小和體積，并且Beckman Coulter公司的Quanta SC已在流式細胞分析系統(tǒng)中引入EV（電子體積）參數(shù)，能測量細胞大小，基于面積差異的分選更為簡單和安全，而X、Y精子頭部面積的可測量差異是研發(fā)這種分選技術(shù)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

天津XY公司有正常繁殖力的171號、176號、203號種公牛；山羊：西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能原種羊場11號公羊；梅花鹿：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種鹿場131號、136號和天津六中藥鹿場0號公鹿。

1.1 藥品及器械設(shè)備 生理鹽水；伊紅Y染液（KH2PO4，6.64 g；Na2HPO4，2.56 g；伊紅 Y4.0g、苯酚 50mL、蒸餾水1 000 mL混勻，37℃放置24h過濾）；臺式高速冷凍離心機（Sigma，3K30，德國SIM）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HHS，江蘇）；顯微鏡（DMBA300-B，Motic，中國）；測尺（OBM-1/100，Olympus，日本）。

1.2 方法 有正常繁殖力的公牛、山羊、梅花鹿精液被流式分選和重分析，X、Y精子分別分裝于0.25 mL細管，液氮冷凍保存待用。

液氮中分別取出3頭牛的X精液、Y精液細管凍精各1管，38℃水浴20 s解凍，精液流入1.5 mL離心管中，加38℃生理鹽水至1.0 mL，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。涂片，干燥后浸入伊紅染液60 s，雙蒸水水洗，自然風干，鏡檢。打開Motic Images Advanced 3.2，在“Motic Mccamera1.1”對話框中進行分辨率（800×600）、相片大小（640×480）等的設(shè)定，設(shè)定完成后點擊“拍照”，拍攝測尺和精子照片。打開測尺照片，鼠標指向工具欄中的“線”，在圖像窗口拖動鼠標進行測尺長度測量，多次測量取其平均值。根據(jù)照片中的測尺長度結(jié)果對比測尺實際長度，計算出照片的放大倍數(shù)，確定精子放大倍數(shù)。打開精子照片，鼠標指向工具欄中的“矩形選區(qū)”，用鼠標在分析對象處畫出矩形區(qū)域，選定所測精子的頭部，單擊工具欄中的“自動單色分割”，點擊工具欄中的“自動計算”，根據(jù)“自動計算結(jié)果”記錄精子頭部面積數(shù)據(jù)。每頭牛X精子和Y精子各不重復(fù)測量數(shù)據(jù)300個。

山羊和梅花鹿方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)收集和處理 收集X精子和Y精子頭部面積數(shù)據(jù)，采用SPSS 11.5軟件中的Compare Means的Paired-Samples T test程序進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 公牛精液分選及X和Y精子頭部面積差異比較 被選的3頭公牛精液分選后重分析的純度均在99.0%以上，其中171#、203#、176#公牛X精子純度分別為99.3%、99.4%和99.7%，Y精子純度分別為99.6%、99.2%和99.5%。由表1可知3頭公牛的總體X精子的頭部面積極顯著高于 Y精子（P＜0.01），X、Y精子面積相差2.96%。

表1 公牛精液X和Y精子頭部面積差異比較（n=300）

2.2 梅花鹿精液分選及X和Y精子頭部面積差異比較

被選的3頭梅花鹿精液分選后重分析的純度均在89.0%以上，其中 131#、136#、0#鹿 X 精子純度分別為91.20%、92.0%、90.0%，Y精子純度分別為 94.1%、93.3%、89.0%。表2結(jié)果顯示3頭梅花鹿的X精子的頭部面積均極顯著高于Y精子（P＜0.01），X、Y精子面積相差1.18%。

表2 梅花鹿精液分選及X和Y精子頭部面積差異比較（n=300）

2.3 薩能奶山羊精液分選及X和Y精子頭部面積差異比較 參加分選的1頭薩能奶山羊公羊精液重分析的純度X精子為94.4%，Y精子為96.8%，薩能奶山羊公羊X和Y精子頭部面積差異比較結(jié)果見表3，結(jié)果顯示11#薩能奶山羊公羊的X精子的頭部面積極顯著高于Y精子（P＜0.01），X、Y 精子面積相差 1.35%。

表3 奶山羊公羊精液X和Y精子頭部面積差異比較（n=300）

3 討論

本試驗采用的有繁殖力的雄性草食動物精液精子分離純度均＞90.0%，其中公牛＞99.0%，梅花鹿＞89.0%，山羊＞94.0%。這對于分析X精子和Y精子頭部差異是非常有利的，是理想的實驗材料。采用伊紅Y染色法，從涂片至鏡檢約10 min，比常規(guī)吉姆薩染色、瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色時間短，且染色效果較好，重復(fù)性好，視野清晰，染色均勻。利于拍照和面積測定。

主觀評價正常精子形態(tài)方法所得結(jié)果往往不穩(wěn)定，電腦輔助精子形態(tài)分析儀已經(jīng)研制成功，為客觀分析精子頭部形態(tài)提供了科學(xué)依據(jù)［13］。本實驗使用Motic Imanges Advanced 3.2系列軟件，通過像素點分割自動計算精子頭部面積，精確度比較高。但實驗通過對所拍攝的精子照片進行像素點分割后自動計算精子頭部面積，因而系統(tǒng)所得的“自動計算結(jié)果”會因像素點、照片大小等的不同而不同，需根據(jù)照片中的測尺長度結(jié)果對比測尺實際長度，計算出照片的放大倍數(shù)，確定精子實際放大倍數(shù)。

本實驗測定結(jié)果中牛、梅花鹿和山羊X、Y精子頭部面積差分別為2.96%、1.18%和1.35%，面積數(shù)據(jù)經(jīng)配對t檢驗，X精子和Y精子頭部面積差異均極顯著（P＜0.01）。人類精子頭部形態(tài)分析研究也發(fā)現(xiàn)X精子和Y精子頭部面積差異的結(jié)果［14］，所有精子頭部面積測定結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，但測定結(jié)果比報道［12，15］的整體偏大，分析其原因可能染色死精子在顯微鏡觀察時看起來比同類型活細胞大。梅花鹿X、Y精子頭部面積差異較小可能和分選純度有較高關(guān)系，而山羊的數(shù)據(jù)只來自1頭公羊，要取得確定的結(jié)果還需要進一步增加實驗樣本數(shù)量。

與測定X精子和Y精子頭部DNA含量的差異分離XY精子相比，測定精子頭部面積差異操作簡便快捷、安全，可在短時間內(nèi)獲得大量可用的分離精子［16］。精子頭部面積差異結(jié)果可為流式細胞儀提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對X、Y精子頭部面積差異分析測定進而實現(xiàn)兩性精子的分離。

4 結(jié)論

牛、梅花鹿、山羊X精子的頭部面積均極顯著高于Y精子；不同分選純度的公牛精液X精子之間、Y精子之間頭部面積差異均不顯著（P＞0.05）。

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Analysis on the Differences between X-and Y-sperm Head Area in Bull，Stag and Goat

Gong Chang-hai1，Wang Hui-e2，3，Gao Qing-hua2，3，et al
（1.Xinjiang Bazhou Station of Animal Husbandry，Kuerle 841000，China；
2.College of Animal Science，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300；3.Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，Xinjiang Production and Construction Group，Alar Xinjiang 843300）

Flow sorted frozen-thaw sperm from bulls（n=3，purity≥ 99%），goat（n=1，purity≥ 94%），sika stags（n=3，purity≥ 91%）with proven fertility were conventionally stained，and their X-and Y-sperm head areas were measured by Motic Images Advanced 3.2 software.The results showed that the X-sperm head area of bull（35.84 μm2± 4.12 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（34.81 μm2± 3.72 μm2）（P ＜0.01），the difference of head areas between X-and Y-sperm was 2.96%；The X-sperm head area of sika stags（33.29 μm2±2.93 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（32.90 μm2±3.25 μm2）（P ＜0.01），the difference was 1.18%；The X sperm head area of goat （8.53 μm2±3.16 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（28.07 μm2±3.19 μm2）（P ＜0.01），the difference was 1.35%.It concluded that the head area of X-sperm in bull，sika stag and goat was significantly higher than that of the Y-sperm.

bull；stag；goat；sperm；flow cytometric；head area

2011-01-24

國家自然科學(xué)

（30760170）；國家科技支撐計劃課題子課題（2008BADB2B05-1-3）

宮昌海（1968-），男，高級畜牧師。

高慶華（1970-），男，教授。E-mail：gsy1997@126.com

1007-9726（2011）03-0009-03

S814.2