劉淑蘭 翟少偉 佘歡歡 賈景濤 宋 凱

殼聚糖對飼料鎘致羅非魚急性毒性的影響

劉淑蘭 翟少偉 佘歡歡 賈景濤 宋 凱

通過兩個試驗研究了殼聚糖對飼料中鎘致羅非魚急性毒性的影響。試驗1將360尾羅非魚隨機(jī)分為兩個處理（對照組和試驗組），每個處理3個重復(fù)，比較殼聚糖添加后飼料鎘致羅非魚96 h半致死劑量的變化情況。對照組一次性投喂鎘水平分別為0.00%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的6種對照飼料；試驗組飼料鎘含量與對照組相同，并加入10%殼聚糖，同法進(jìn)行飼料鎘對羅非魚的急性毒性試驗。試驗2將160尾羅非魚隨機(jī)分為兩個處理，每個處理4個重復(fù)，分別投喂鎘含量為0.50%的對照組和試驗組飼料，研究飼料中添加殼聚糖對鎘致羅非魚半致死時間的影響。試驗結(jié)果為：兩個試驗中試驗組魚的死亡率均低于對照組；對照組96 h半致死劑量（LD50）和半致死時間（LT50）分別為（49.67±6.11）mg/kg·BW 和（47.76±3.03）h，試驗組 96 h LD50和 LT50分別為（86.05±6.11）mg/kg·BW和（65.20±6.09）h，試驗組 96 h LD50和 LT50與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），表明殼聚糖能夠緩解飼料中鎘對羅非魚的急性毒性。

殼聚糖；飼料鎘；羅非魚；急性毒性

重金屬作為一種持久性生物體污染物，已受到世界范圍內(nèi)人們的廣泛關(guān)注。水產(chǎn)品重金屬污染是一個比較普遍的食品安全問題，鎘的殘留是其重點監(jiān)測項目之一（鄭宗林等，2003）。鎘是機(jī)體生長發(fā)育的非必需元素，對人和動物健康具有嚴(yán)重危害，可造成魚體多種組織器官損傷，進(jìn)而干擾魚體各種生理功能（Gomot等，1998；Lam 等，1998；孫德文等，2003）。飼料是魚體中鎘的主要來源之一，飼料中的鎘主要來源于飼料原料（如魚粉、礦物質(zhì)添加劑等）以及加工過程（王丹紅等，2004）。目前，開發(fā)飼料重金屬吸附劑是減輕飼料鎘對水產(chǎn)動物危害的重要途徑。

殼聚糖是幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的產(chǎn)物。目前已廣泛用作一種水產(chǎn)和畜牧業(yè)飼料添加劑，用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制病菌生長以及促進(jìn)動物生長等方面（鄭宗林等，2004）。在水處理方面，殼聚糖是一種良好的重金屬離子吸附劑，其對Cd2+吸附率可達(dá)95%（代淑娟等，2007）。目前利用殼聚糖吸附水環(huán)境中的重金屬離子已成為一個研究熱點（陳亮等，2001；丁純梅等,2007），而殼聚糖作為飼料添加劑能否在魚體腸道環(huán)境中吸附來源于飼料中的鎘，進(jìn)而緩解鎘對魚類的毒性作用還未見報道。本研究以羅非魚為試驗動物，探討飼料中殼聚糖對鎘致羅非魚急性毒性的影響，為殼聚糖在魚類養(yǎng)殖中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及試驗設(shè)計

試驗用魚為吉富羅非魚，購于廈門市杏林誠毅水產(chǎn)公司。

試驗1：經(jīng)多次預(yù)試驗，初步確定飼料鎘致羅非魚24 h最高無死亡劑量和最低絕對致死劑量。將360尾健康無病，平均體重為（2.03±0.12）g/尾，平均體長為（4.39±0.15）cm/尾的羅非魚隨機(jī)分為兩個處理，即對照組和試驗組，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)60尾，每缸隨機(jī)放入試驗魚10尾。

試驗2：將160尾健康無病，平均體重為（2.73±0.29）g/尾，平均體長為（4.55±0.53）cm/尾的試驗魚隨機(jī)分為兩個處理組（對照組和試驗組），每組4個重復(fù)，每個重復(fù)20尾。對照組投喂鎘水平為0.5%的飼料，試驗組投喂鎘水平與對照組相同且添加10%殼聚糖的飼料，投喂方法與試驗1相同。

1.2 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料配方見表1。

對照組飼料在基礎(chǔ)飼料中添加10%微結(jié)晶纖維素和不同含量氯化鎘，配制成鎘含量分別為0.00%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%和 2.00%的對照飼料；試驗組飼料在對照組飼料的基礎(chǔ)上，用10%殼聚糖等量替換結(jié)晶纖維素，飼料鎘水平與對照組相同。

表1 基礎(chǔ)飼料配方

殼聚糖購于山東奧康生物科技有限公司，食品級，脫乙酰度≥90%，分子量約為3×105。

1.3 飼養(yǎng)管理

羅非魚在220 cm×80 cm×100 cm的養(yǎng)殖水箱中暫養(yǎng) 2周，持續(xù)充氧，水溫 28～32 ℃，pH 值 6.4～7.5，溶解氧 5～8 mg/l。每日投喂 3次（8:00、13:00和 18:00）基礎(chǔ)飼料，日投喂量為魚體重的6%。每天定時吸污、換水，換水量為100%。暫養(yǎng)期間，羅非魚健康無病，日平均死亡率為0.01%。

1.4 試驗條件

試驗用水為充分曝氣自來水,水溫為28～30℃，pH 值 6.4～7.5，溶解氧 5～8 mg/l，硬度約 2.2 度（德國度）。試驗在30 cm×26 cm×22 cm的玻璃缸中進(jìn)行，每缸加入10 L曝氣自來水。

1.5 試驗步驟

試驗1初始，各處理組飽食投喂一次，30 min后撈取每缸剩余飼料，烘干并稱重，計算各組平均每千克體重鎘的攝食量。試驗前24 h停止投喂，試驗期間不投喂。每天觀察并記錄各處理組試驗魚中毒癥狀和死亡情況，連續(xù)記錄96 h。試驗2投喂方法與試驗1相同，每12 h記錄各處理組死亡情況,連續(xù)記錄96 h。

1.6 評價指標(biāo)

死亡率 （%）=100×（初始魚尾數(shù)-終末魚尾數(shù)）/初始魚尾數(shù)。

半致死劑量是使受試羅非魚半數(shù)死亡的飼料鎘劑量，用LD50表示。

半致死時間是使受試羅非魚半數(shù)死亡的時間，用LT50表示。

根據(jù)米靜潔等（2008）的計算方法，利用試驗期間死亡魚數(shù)及死亡時間，采用概率單位體重-劑量對數(shù)直線回歸法和概率單位-時間對數(shù)直線回歸法計算96 h半致死劑量LD50和半致死時間LT50。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。利用SPSS11.0軟件的Probit模塊計算半致死劑量及半致死時間，One-Way ANOVA法進(jìn)行方差分析（P＜0.05表示均數(shù)間差異顯著，P＜0.01表示均數(shù)間差異極顯著）。

2 結(jié)果

2.1 試驗魚中毒癥狀

投喂試驗飼料后，試驗魚在24 h內(nèi)游動如常。30 h后高劑量組出現(xiàn)異常反應(yīng)，中毒魚表現(xiàn)為狂游、跳躍、易受驚嚇、呼吸速度明顯加快，體色變黑；隨后游動緩慢，反應(yīng)遲鈍，逐漸喪失運動能力而靜止在底部，最后死亡。低劑量組試驗魚出現(xiàn)中毒癥狀需要時間較長，中毒癥狀與高劑量組基本相同。死亡魚鰓部水腫，呈紫紅色，鰓蓋周圍及腹部點狀出血。

2.2 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚死亡率及半致死劑量的影響

殼聚糖對飼料鎘致羅非魚的96 h死亡率及半致死劑量（LD50）的影響見圖1和圖2。試驗組魚的死亡率在96 h內(nèi)均低于對照組，或與之相同，兩者呈現(xiàn)出低劑量組和高劑量組差異小，而中劑量組差異顯著的趨勢；投喂鎘含量為0.25%的試驗組96 h死亡率極顯著低于對照組（P＜0.01），投喂鎘含量為0.5%的試驗組96 h死亡率顯著低于對照組（P＜0.05），其他鎘水平組間的死亡率差異不顯著（P＞0.05）。對照組鎘致羅非魚的 96 h半致死劑量（LD50）為（49.67±6.11）mg/kg BW，試驗組96 h LD50為（86.05±6.11）mg/kg BW，試驗組 96 h LD50極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖1 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚96 h死亡率的影響

圖2 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚96 h LD50的影響

2.3 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚死亡率及半致死時間的影響

殼聚糖對飼料鎘致羅非魚的死亡率變化和半致死時間（LT50）的影響見圖3和圖4。試驗組羅非魚的死亡率在96 h內(nèi)均低于對照組，尤其在36 h和48 h時兩組差異極顯著（P＜0.01），60 h時兩組差異顯著（P＜0.05），其他時間點差異不顯著（P＞0.05）。對照組鎘致羅非魚的LT50為（47.76±3.03）h（95%置信區(qū)間為42.94～52.99 h），試驗組 LT50為（65.20±6.09）h（95%置信區(qū)間為55.51～74.89 h）,試驗組鎘致羅非魚的半致死時間極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖3 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚96 h死亡率的影響

圖4 殼聚糖對飼料鎘致羅非魚LT50的影響

3 討論

試驗中羅非魚的中毒癥狀與其他學(xué)者觀察到的鎘對魚類的急性中毒癥狀相似（翟毓秀等，2005；Witeska等，2006）。中毒初期，魚表現(xiàn)出跳躍、沖撞、上下翻滾、快速游動等行為；中毒后期表現(xiàn)為乏力，失去平衡，下沉死亡。魚類重金屬中毒時，鰓部會分泌大量黏液，形成絮狀沉積物，使魚鰓阻塞，引起呼吸障礙，浮游于水表層。該試驗與其他學(xué)者（陳貴良等，2004）觀察到部分羅非魚鎘中毒后，其體色也逐漸呈現(xiàn)黑色等現(xiàn)象相一致。

研究中，試驗組的死亡率總體上低于對照組，96 h LD50和LT50均顯著高于對照組，表明殼聚糖通過吸附作用可能降低了腸道中游離態(tài)鎘的含量，從而緩解了鎘對羅非魚的毒性。Ren等（2006）的研究表明，飼料中添加3%水溶性殼聚糖可以降低虹鱒魚肝臟、腎臟以及肌肉對飼料鎘的累積。試驗中所用殼聚糖為高分子量殼聚糖，它能夠顯著影響鎘對羅非魚的毒性，這種差異可能與試驗動物種類及其體內(nèi)存在的殼聚糖降解相關(guān)酶的活性有關(guān)。

殼聚糖分子鏈中存在大量帶孤對電子的活性基團(tuán)（-NH2和-OH）。研究表明，-NH2是殼聚糖吸附鎘的活性基團(tuán)，-OH不參與吸附反應(yīng)。吸附的過程中存在著化學(xué)吸附和物理吸附兩種形式，在化學(xué)吸附中，2個氨基與1個Cd2+通過電價配鍵形成穩(wěn)定的電價絡(luò)合物（王志華等，2001；李建勇，2004），從而降低重金屬鎘離子的毒性。殼聚糖體外吸附Cd2+的最佳pH值為 6.0～8.0（代淑娟等，2007；丁純梅等，2007），而羅非魚腸道內(nèi) pH 值范圍是 7.2～8.3（Maier等，1984）。因此兩者的結(jié)合態(tài)在魚腸道內(nèi)可以穩(wěn)定存在；殼聚糖還能夠優(yōu)先與鎘結(jié)合并將其帶出體外（孫繼鵬等，2010），從而減少魚體對重金屬鎘的吸收。隨糞便排出體外的殼聚糖與鎘絡(luò)合物，在水環(huán)境中可穩(wěn)定存在，不會繼續(xù)對魚體產(chǎn)生毒害作用（李秋明，2010）。

4 結(jié)論

試驗表明，殼聚糖能夠吸附羅非魚腸道環(huán)境中的鎘，降低腸道中游離態(tài)鎘的濃度，減少魚體對Cd2+的吸收，從而降低其死亡率，使鎘致羅非魚的半致死劑量和半致死時間顯著增加（P＜0.01），說明殼聚糖可以緩解飼料鎘對羅非魚的急性毒性作用。

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The effect of chitosan on the acute toxicity of dietary cadmium to tilapia

Liu Shulan,Zhai Shaowei,She Huanhuan,Jia Jingtao,Song Kai

Two experiments were conducted to evaluate the effect of chitosan on the acute toxicity induced by dietary cadmium to Tilapia.The effects of chitosan in diet on the mortality rate and the 96 h median lethal dose （LD50）were studied in the first experiment.360 Tilapa were randomly divided into two treatment groups （the control group and the experimental group）with three replicates in each treatment and 60 fish per replicate.Tilapia of the control group was exposed to dietary Cd at concentrations of 0.00%,0.10%,0.25%,0.50%,1.00%and 2.00%.The dietary Cd level of the experimental group with 10 percent of chitosan was the same as the control group.160 Tilapa were used to investigate the effect of chitosan in diet on the half lethal time （LT50）in the second experiment.The fish was randomly divided into two treatment groups（the control group and the experimental group）with four replicates in each treatment and 20 fish per replicates.The control group was fed with the diet containing 0.50%cadmium,and the treatment group was fed with the corresponding experimental diet containing 0.50%cadmium and 10%chitosan.The results showed that the mortality rates of the experimental group in the two experiments were lower than those of the control group.The 96 h LD50and LT50of the control group were （49.67±6.11）mg/kg （body weight）and （47.76±3.03）hours,respectively.While the experimental group were （86.05±6.11）mg/kg （body weight）and （65.20±6.09）hours,respectively.The significant differences were found between 96 h LD50and LT50of the control group and those of experimental groups （P＜0.01）.The results in present study suggested that chitosan could decrease the toxicity of dietary cadmium to tilapia.

chitosan；dietary cadmium；tilapia；acute toxicity

項目來源：福建省教育廳科技項目[JA10190]；福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點實驗室開放基金[2009J301]；集美大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師基金[2008C002]資助

S965.125

A

1001-991X（2011）10-0042-04

劉淑蘭，集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點實驗室，361021，福建省廈門市印斗路43號。

翟少偉（通訊作者）、佘歡歡、賈景濤、宋凱，單位及通訊地址同第一作者。

2011-01-05

（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）