譚元生，雍蘇南，唐 瑩，張 穩(wěn)

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

中醫(yī)不同治法對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

譚元生，雍蘇南，唐 瑩，張 穩(wěn)

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察中醫(yī)不同治法補(bǔ)氣、活血、化痰對大鼠心肌缺血再灌注（I/R）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bc1-2、Bax和氧自由基含量的影響。方法 建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化在體心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)免疫組化法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，常規(guī)方法檢測丙二醇（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果 與I／R組比較，中醫(yī)補(bǔ)氣、活血、化痰法均能降低AI，有效清除氧自由基，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I／R組比較，其中活血法和化痰法均能上調(diào)Bc1-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），最終達(dá)到保護(hù)I／R心肌的目的。結(jié)論 中醫(yī)不同治法補(bǔ)氣、活血、化痰可能通過不同途徑預(yù)防I／R心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而對I／R心肌具有保護(hù)作用。

心肌缺血再灌注損傷；補(bǔ)氣法；活血法；化痰法；保元湯；血府逐瘀湯；瓜蔞薤白半夏湯；基因表達(dá)；氧自由基；大鼠

缺血性心臟病是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病之一，其基本的治療原則是恢復(fù)血流再灌注。但盡管血流恢復(fù)再灌注，心肌損傷反有加重，我們稱這種現(xiàn)象為心肌缺血再灌注損傷 (myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。 隨著治療缺血性心臟病的新技術(shù)、新療法在臨床的發(fā)展和應(yīng)用，MIRI出現(xiàn)的幾率將更大，因而其防治尤顯重要。MIRI參與因素眾多，機(jī)制復(fù)雜，中醫(yī)學(xué)的整體觀辨證論治特色對此有其特有的優(yōu)勢，中醫(yī)藥在防治MIRI及其并發(fā)癥方面具有很大潛力。本文在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，從分子水平探討補(bǔ)氣、活血、化痰不同中醫(yī)治法拮抗MIRI細(xì)胞凋亡機(jī)制的異同，對臨床治療缺血性心臟病提出新的觀點(diǎn)。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性wistar大鼠50只，體質(zhì)量（270±25）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。 許可證號：SCXK（滬 2007-0008）。

1.1.2 藥物 補(bǔ)氣法選擇保元湯（黃芪、人參、肉桂、甘草）；活血法選用血府逐瘀湯（桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）；化痰法選用瓜蔞薤白半夏湯（瓜蔞、薤白、半夏、白酒）。所有藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.1.3 儀器 Micro-ESR型電子自旋共振波譜儀，美國產(chǎn)；TD5-Ⅱ臺式離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司生產(chǎn)；721分光光度計(jì)，上海第三儀器廠生產(chǎn)；SSW型電熱恒溫水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司提供；Thermo Shandon切片機(jī)，英國產(chǎn)；LKB-Ⅱ型超薄切片機(jī)，瑞典產(chǎn)；OPTON萬能光學(xué)顯微鏡，德國產(chǎn)；H-600透射電鏡，日本產(chǎn)。

1.1.4 試劑 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Bcl-2、Bax免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD),丙二醛（malondialdehyde,MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 參照參考文獻(xiàn)[1]的方法，制備高脂乳劑，對50只wistar大鼠按10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)12周。隨機(jī)抽取2只大鼠，處死后速取主動(dòng)脈，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)已形成粥樣硬化斑塊，提示造模成功。隨機(jī)分成5組，即假手術(shù)組（sham 組）、IRI模型組(I／R 組)、補(bǔ)氣法組（BQ組）、活血法組（HX組）、化痰法組（HT組），每組10只動(dòng)物。在大鼠AS模型的基礎(chǔ)上，手術(shù)建立大鼠MIRI模型：大鼠稱質(zhì)量后氯胺酮80 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。氣管切開接呼吸機(jī)人工呼吸，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸后以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。以心電圖ST段明顯抬高、結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端心肌發(fā)紺為結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，復(fù)流3 h。sham組只穿線不結(jié)扎冠脈。

1.2.2 藥物的制備及給藥方法 保元湯、血府逐瘀湯、瓜蔞薤白半夏湯分別為水煎劑按照參考文獻(xiàn)[2]制備；給藥劑量均按60 kg成人與動(dòng)物體表面積換算，保元湯以生藥0.95 g/kg，血府逐瘀湯以生藥1.37 g/kg，瓜蔞薤白半夏湯以生藥0.59 g/kg，給藥體積均按1 mL/100 g計(jì)算，于缺血再灌注前30 min給大鼠灌胃，缺血再灌注組給予等量生理鹽水。

1.2.3 心肌凋亡細(xì)胞原位檢測 采用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP-生物素平移末端標(biāo)記技術(shù)-TUNEL法(TdT-mediated dUTP end labeling)標(biāo)記凋亡心肌細(xì)胞。具體操作步驟是切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制3% H2O2，室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；標(biāo)本片加0.1 M TBS 1∶200新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化12 min，0.1 M TBS洗2 min×3次；標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液20 μL／片，以保持切片濕潤；按每張切片取TdT 和 DIG-dUTP 各1 μL， 加入 18 μL 標(biāo)記緩沖液中，混勻；甩去多余液體后加標(biāo)記液20 μL／片，置于濕盒中37℃標(biāo)記2 h；0.1 M TBS洗2 min×3次，加封閉液5 μL／片，室溫3 μL后甩掉封閉液；用封閉液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，5 μL／片加至標(biāo)本片上，置于濕盒中37℃反應(yīng)30 min，0.1 M TBS 洗 2 min×3 次；取 1 mL 0.1 M TBS加SABC 10 μL，混勻后加至切片，37℃反應(yīng)60 min，0.1 M TBS洗 5 min×4次 。 DAB 顯 色30 min，水洗：蘇木素輕度復(fù)染，0.1 M TBS洗，蒸餾水洗，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。上述步驟中每組各選1張切片不加TdT酶(加等量蒸餾水)作為陰性對照。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)于×400物鏡下取5個(gè)視野，每組共40個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。AI=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)／視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1.2.4 Bcl-2、Bax基因蛋白表達(dá)的檢測 采用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。主要步驟：切片脫蠟入水→新配1%H2O2溶液封閉內(nèi)源性POD 10 min→分別加入Bc1-2、Bax蛋白抗體，4℃過夜→PBS(pH 7.4)漂洗→加生物素化二抗37℃孵育2 h→加SABC 37℃孵育30 min→DAB顯色→蘇木素復(fù)染→光鏡觀察。上述步驟中不加一抗、二抗作為陰性對照。胞漿著棕黃色者為陽性表達(dá)細(xì)胞。在光鏡下200倍放大，通過圖像分析系統(tǒng)每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，測定陽性染色的平均光密度與陽性細(xì)胞百分比，計(jì)算蛋白陽性表達(dá)指數(shù) (positive expression index，PEI)：PEI=平均光密度×陽性細(xì)胞百分比×100，并求出Bax／Bcl-2的比值。

1.2.5 氧自由基的檢測 采用電子共振自旋波頻譜儀定量檢測心肌細(xì)胞氧自由基量。用黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD活性，用硫代巴比妥(TBA)法檢測MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 14.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD），給藥前、后比較采用配對t檢驗(yàn)。采用“”表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

光鏡下觀察，Sham組偶見凋亡陽性細(xì)胞，I／R組有大量的心肌細(xì)胞凋亡，且積聚成團(tuán)，AI顯著高于sham組（P＜0.01）。BQ組、HX組及HT組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)均較I／R組明顯減少（P＜0.01）。見表1。

2.2 對各組大鼠Bcl-2與Bax基因蛋白表達(dá)的影響

在sham組中，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量都較少，Bax/Bcl-2比值接近 1；與 sham組比較，I／R組Bc1-2蛋白和Bax的表達(dá)量均有所上升(P<0.01)，但以Bax蛋白表達(dá)更明顯，Bax／Bc1-2顯著增高 (P<0.01)；與I／R組比較，BQ組 Bc1-2和 Bax的表達(dá)量無明顯上升 (P＞0.05)；HX組、HT組與 I／R組比較，Bc1-2蛋白的表達(dá)量顯著升高 (P<0.01)，Bax蛋白的表達(dá)量則明顯下降(P<0.01)，Bax／Bc1-2也顯著低于I／R 組(P<0.01)，見表 1。

表1 各組大鼠AI及凋亡相關(guān)蛋白的變化（n＝10，）

表1 各組大鼠AI及凋亡相關(guān)蛋白的變化（n＝10，）

注：與 sham 組比較 #P＜0.01；與 I／R 組比較△P＜0.01。

組 別sham組I／R 組BQ組HX組HT組藥物劑量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 AI(%)3.2±0.7 30.6±7.1#15.8±5.6#△16.4±6.2#△16.9±5.3#△Bc1-2蛋白0.24±0.03 7.42±2.13#7.44±2.08#16.87±4.92#△17.68±4.85#△Bax蛋白0.22±0.04 18.24±5.49#18.14±5.41#5.84±1.14#△5.43±1.21#△Bax/Bcl-2 0.89±0.33 3.23±0.10#3.26±0.11#0.34±0.58#△0.31±0.61#△

2.3 對各組大鼠心肌SOD、MDA含量的影響

sham組心肌組織的SOD具有較高的活性，MDA處于較低的水平。I／R組同sham組比較，則有明顯的氧化趨勢，SOD活性顯著降低 (P<0.01)，MDA含量顯著增高 (P<0.01)；3種中醫(yī)治法組同I/R組比較，MDA含量均明顯降低 (P<0.01)，SOD活性均顯著增高(P<0.01或 P<0.05)；其中補(bǔ)氣法和活血法在降低MDA含量、升高SOD活性方面優(yōu)于化痰法，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。 見表 2。

表2 各組大鼠心肌 SOD、MDA 含量的變化（n＝10，）

表2 各組大鼠心肌 SOD、MDA 含量的變化（n＝10，）

注：與 sham 組比較 #P＜0.01；與 I／R 組比較△P＜0.01；與BQ 組比較※P＜0.05。

組 別sham組I／R 組BQ組HX組HT組藥物劑量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 SOD（mkat/g）2.75±0.30 1.35±0.16#2.21±0.25#△2.19±0.27#△1.80±0.24#※MDA（μmol/g）5.94±1.23 17.21±2.48#7.84±1.71#△7.91±1.82#△9.52±1.64#△※

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死早期再灌注治療過程中一個(gè)嚴(yán)重的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)是心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌缺血再灌注后凋亡明顯增多，而使用3種不同中醫(yī)治法的方藥后凋亡細(xì)胞明顯減少，說明補(bǔ)氣、活血、化痰3種中醫(yī)治法均可預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡。在心肌缺血／再灌注損傷中，凋亡的發(fā)生是受細(xì)胞周圍的刺激信號誘導(dǎo)或抑制，并由特定的基因控制。MIRI中產(chǎn)生的自由基，細(xì)胞內(nèi)鈣超載等均是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素。這些因素并不直接引起細(xì)胞凋亡，而是通過一定的信號傳遞方式激活生存或死亡相關(guān)基因，然后將信號傳遞到核內(nèi)切酶，而執(zhí)行死亡的功能。細(xì)胞凋亡由細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因直接控制，Bax蛋白基因與Bc1-2蛋白基因具有高度的同源序列，Bax蛋白與Bc1-2蛋白可相互結(jié)合形成結(jié)合體，過度表達(dá)Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用。因此，Bax蛋白和Bc1-2蛋白表達(dá)的比例決定細(xì)胞是生存還是凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sham組中Bcl-2和Bax及凋亡細(xì)胞表達(dá)很少，而I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)增加，有報(bào)道認(rèn)為與心肌細(xì)胞受到缺血再灌注過程的刺激而反應(yīng)性表達(dá)，以提高細(xì)胞的內(nèi)在抵抗能力有關(guān)[3]；但Bax蛋白表達(dá)更多，Bax蛋白／Bcl-2蛋白比值增大，凋亡細(xì)胞增多，這進(jìn)一步證明了Bax／Bcl-2比值與細(xì)胞凋亡的密切關(guān)系；給予3組不同治法的方藥治療后，HX組和HT組Bc1-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，Bax／Bcl-2比值下降，而BQ組的Bax和Bc1-2表達(dá)無明顯改善，提示活血法、化痰法可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，以減輕心肌缺血再灌注損傷，而補(bǔ)氣法可能從其他分子途徑拮抗MIRI。

心肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生是再灌注心肌損傷發(fā)病的重要機(jī)制之一。超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)存在的一種抗氧自由基酶,其活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基(OFR)的能力[4]，MDA為OFR發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中形成的脂質(zhì)過氧化物,其水平間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。兩者的變化可反映心肌的抗氧化能力[5]。本實(shí)驗(yàn)顯示：與I／R組比較，3個(gè)中藥治療組大鼠在經(jīng)歷I／R后，其SOD活性均明顯增高，MDA含量均明顯降低，提示中醫(yī)補(bǔ)氣、活血、化痰法均能夠有效清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化能力。但HT組在增高SOD活性及降低MDA含量方面均無BQ組、HX組明顯，說明中醫(yī)補(bǔ)氣、活血、化痰法均能通過促進(jìn)清除大鼠心肌細(xì)胞I／R時(shí)所產(chǎn)生的氧自由基，減輕在體大鼠I／R心肌細(xì)胞凋亡，但化痰法清除氧自由基的作用效果不及補(bǔ)氣法和活血法。

本實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)氣、活血、化痰3種中醫(yī)治法均能有效預(yù)防MIRI后的細(xì)胞凋亡，其中活血、化痰法主要通過清除氧自由基，上調(diào)Bc1-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，最終達(dá)到保護(hù)I／R心肌的目的；補(bǔ)氣法則主要通過清除氧自由基來預(yù)防I／R心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，減輕I／R損傷。而關(guān)于補(bǔ)氣、活血、化痰這3種治療缺血性心臟病常用中醫(yī)治法對I／R心肌細(xì)胞凋亡影響的其他分子機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

[1]劉 明，董超仁，蘇靜怡.一種簡便實(shí)用的大鼠高脂模型[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1989，5（2）：119.

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[4]Von Harsdoff R， Li P F，Dietz R.Signaling pathways in reactive oxy-gen species-induced cadiomyocyte apoptosis[J].Circulation，1999，99(22)：2 934-2 941.

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（本文編輯 彭芝配）

Effect of different treatments in TCM on myocyte apoptosis in myocardial ischemia reperfusion in rats

TAN Yuan-sheng， YONG Su-nan，TANG Ying，Zhang Wen
(First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effect of different treatments in TCM on myocyte apop tosis and expression of Bc1-2 and Bax and the content of oxygen free radicals in myocardial is chemiareperfusion in rats.Method The rats models in vivo of atherosclerosis myocardial is chemia reperfusion were stablished,the apoptosis index(AI)was detected withTUNEL method in situ end method,the apoptos is related genes Bcl-2Chain and Bax protein expression with avidin-bi otin-enzyme complex(SABC)immunohistochemical method,and the activity ofsuperox ide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)with routine method.Results Compared with I/R group,all the treatments in TCM could reduce AI and remove effectively the oxygen free radicals（P＜0.01）,the activating blood and resolving phlegm methods could reduce the content of MDA and increase the activity of SOD and decrease Bax expression（P＜0.01）,and then,protect 1/R cardiac muscle.Conclusion The different treatments in TCM can restrain the apoptosis of I／R cardiac muscle cells and to protect consequently the I／R cardiac muscle.

book=146,ebook=146

apoptosis;benefiting Qi therapy;activating blood therapy;resolving phlegm therapy;Baoyuan decoction;Xuefu Zhuyu decoction;Gualou Xiebai Banxia decoction;gene expression;oxygen free radicals;rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.005.018.04

2010-11-08

湖南省教育廳科研項(xiàng)目（06C624）。

譚元生（1962-），男，湖南益陽人，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病的中醫(yī)藥防治研究。