李喜鳳， 郝 哲， 邱天寶， 許 閩， 余云輝， 杜云鋒

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008;2.中國人民解放軍第一五三中心醫(yī)院藥械科，河南鄭州450042)

蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.為臨床常用中藥，有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋之功效。蒲公英含有多種活性成分，如黃酮類，皂苷類，有機(jī)酸類，多糖等。其中咖啡酸和綠原酸具有明顯的抑菌作用，阿魏酸具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用［1］。目前對于蒲公英藥材及其制劑提取工藝的研究較少［2-7］，本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法以咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量為考察指標(biāo)，用高效毛細(xì)管電泳法［8-14］進(jìn)行測定，篩選出了蒲公英中3種有機(jī)酸成分的最佳提取工藝。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 美國Beckman公司P/ACETMMDQ毛細(xì)管電泳儀，DAD檢測器 ，Karat 32系統(tǒng)軟件，未涂層石英毛細(xì)管柱(75 μm ID×50/57 cm，分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)，PHS-2SB型數(shù)字酸度計(jì)(上海大譜儀器有限公司)，YUEPINGFA2004b型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 蒲公英藥材采于河南省不同地區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定均為菊科植物蒲公英T.mongolicum Hand-Mazz的干燥全草?？Х人釋φ掌?批號:110885-200102)，綠原酸對照品(批號:110753-200413)，阿魏酸對照品(批號:0773-9809)均由中國藥品生物制品檢定所提供。水為娃哈哈純凈水，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件 電壓18 KV;壓力進(jìn)樣0.5 psi;進(jìn)樣時間5 s;檢測波長325 nm;溫度25℃;硼砂濃度20 mmol/L(1 mol/L NaOH調(diào)pH 9.55)。

2.2 毛細(xì)管預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)前依次用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、緩沖液依次沖洗10、10、20 min，進(jìn)樣前分別用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、緩沖液依次沖洗3、2、3 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用 NaOH(0.1 mol/L)溶液、水沖洗10 min。所用溶液進(jìn)樣前均用0.45 μm的濾膜過濾，并超聲脫氣3 min。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸、綠原酸、阿魏酸對照品適量加70%甲醇溶解并制成濃度為0.097 6、0.084 8、0.005 4 mg/mL 的溶液，搖勻，作為對照品貯備液，見圖1。

2.4 供試品溶液的制備 取蒲公英細(xì)粉1 g，精密稱定，按L9(34)工作表制備樣品溶液，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖萃取4次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得，見圖2。

圖2 供試品HPCE圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密量取咖啡酸、綠原酸、阿魏酸混合對照品溶液 1、2、4、6、8 mL分別置 10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻。按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣，測定各組分的峰面積，以濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程:咖啡酸的回歸方程為Y=1×106X-1 115，r=0.999 8，線性范圍為:0.009 76～0.078 08 mg/mL;綠原酸的回歸方程為Y=48 894X-1 387.3，r=0.999 8，線性范圍為:0.008 48～0.067 84 mg/mL;阿魏酸的回歸方程為Y=791 926X-78.689，r=0.999 9，線性范圍為:0.000 54～0.004 32 mg/mL。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一咖啡酸、綠原酸、阿魏酸混合對照品溶液，在上述分離條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，其峰面積的RSD分別為1.8%、1.9%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批蒲公英樣品5份，按下述正交試驗(yàn)最佳提取工藝制備供試品溶液，測得咖啡酸峰面積的RSD為1.7%，綠原酸峰面積的RSD為1.23%，阿魏酸峰面積的RSD為1.9%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述樣品溶液，每隔2 h進(jìn)樣，連續(xù)10 h，結(jié)果咖啡酸峰面積的 RSD為1.7%，綠原酸的峰面積的RSD為1.7%，阿魏酸峰面積的RSD為1.8%。表明咖啡酸、綠原酸、阿魏酸在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知咖啡酸、綠原酸、阿魏酸含量的蒲公英樣品9份，分別按80%、100%、120%三個濃度精密加入對照品溶液適量，制備供試品溶液，結(jié)果顯示咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的平均回收率為97.71%、97.96%、98.24%;RSD值為1.05%、1.44%、0.96%。

2.6 單因素提取工藝篩選試驗(yàn)及結(jié)果

2.6.1 乙醇濃度的影響 準(zhǔn)確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，分別加60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇20 mL水浴回流1.5 h，按2.1項(xiàng)下電泳條件進(jìn)樣，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結(jié)果顯示80%乙醇提取效果較好，見圖3。

2.6.2 回流時間的影響 準(zhǔn)確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，分別加80%乙醇20 mL 水浴回流0.5、1、1.5、2、2.5 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結(jié)果顯示回流2 h效果最佳，見圖4。

圖3 乙醇濃度的影響

圖4 回流時間的影響

2.6.3 溶劑量的影響 準(zhǔn)確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，分別加80%乙醇10、20、30、40、50 mL，水浴回流 2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸及的含量，結(jié)果顯示溶劑量為40 mL提取效果較好，見圖5。

2.6.4 提取次數(shù)的影響 準(zhǔn)確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，分別加80%乙醇20 mL水浴回流，3組分別提取1次、2次、3次，每次2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結(jié)果差別不大，故選擇提取1次為宜。

圖5 料液比的影響

2.6.5 不同藥材粒度的影響 準(zhǔn)確稱量不同粒度的蒲公英粉末(粗粉、50目、65目、120目)1 g共8份，4組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，分別加80%乙醇20 mL水浴回流2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量，結(jié)果顯示藥材粒度為50目較好，但相差不大，故不做為正交因素考察。

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 通過上述單因素試驗(yàn)確定3因素3水平作為正交試驗(yàn)的因素和水平，進(jìn)一步確定最佳提取工藝。因素水平表見表1，L9(34)正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果，見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)

由直觀分析可知，影響提取效果的因素為:A(乙醇濃度)＞B(溶劑量)＞C(提取時間)，以乙醇濃度影響最大，溶劑量次之，提取時間影響最小。經(jīng)方差分析可知:乙醇濃度對提取效果影響最顯著，溶劑量對提取效果影響顯著，提取時間對提取效果無顯著性差異，為節(jié)約生產(chǎn)成本，確定最佳提取條件為A2B3C1。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察上述工藝的穩(wěn)定可行性，精密稱定蒲公英藥材1 g，按優(yōu)選工藝A2B3C1重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果見表4。

表3 方差分析表

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，按優(yōu)選的最佳提取工藝提取，有效成分提取效果好，表明該工藝合理穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果表明，蒲公英中有機(jī)酸的最佳提取條件為:80%乙醇，料液比為1∶40，水浴回流1.5 h，各有機(jī)酸的提取率均較高。

3.2 以多種有效成分為指標(biāo)評價(jià)成分復(fù)雜的中藥材，具有一定的科學(xué)合理性，本實(shí)驗(yàn)以蒲公英的主要有效成分咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量為指標(biāo)研究最佳提取工藝，同時根據(jù)各成分在藥效中所起的作用賦予不同的權(quán)重系數(shù)綜合評分進(jìn)行評價(jià)，避免了對多指標(biāo)單獨(dú)評價(jià)時相互間的沖突。

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