戴 冰， 肖子曾， 冷 旺， 梅 君

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208)

在真核生物中，外部信號從細胞膜到細胞核影響基因的轉(zhuǎn)錄變化涉及許多信號通路，環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號途徑是其中的范例之一。有研究表明，六味地黃湯能改善和調(diào)節(jié)陰虛型小鼠血漿cAMP系統(tǒng)［1］，而目前研究六味地黃方對cAMP的作用主要停留在血液中cAMP的階段，為了進一步闡明該方對細胞內(nèi)cAMP的作用，我們選用了大鼠前脂肪細胞作為研究對象，來探討六味地黃丸的藥理作用與cAMP的關(guān)系;同時有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素可明顯升高RPE細胞內(nèi)cAMP水平，其作用機制是通過結(jié)合RPE細胞膜上β-AR，使細胞內(nèi)cAMP濃度增加［2］。因此我們選用腎上腺素作用大鼠前脂肪細胞，旨在探討六味地黃丸對細胞內(nèi)cAMP水平的影響及其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物與藥物 健康SD大鼠，清潔級，♀♂各半，體重(200±20)g，由長沙市開福區(qū)東來創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)中心提供，許可證號:SCXK(湘)2006-0001。六味地黃丸(濃縮丸)，由湖南省長沙九芝堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號為060361。

1.2 試劑與儀器 腎上腺素(批號:20060514)，pH7.2緩沖生理鹽水(自制)，含酚紅 DMEM低糖培養(yǎng)基(批號123K83031)購自 Sigma公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(批號20050617)購自蘭州民海生物有限公司，胰酶購自sigma公司，cAMP試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室，其余試劑均為分析純;3K30型高速冷凍離心機(sigma公司產(chǎn)品)，UV-1600紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品)，佳能照相系統(tǒng)，XDS-1B體式倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，Heracell型細胞培養(yǎng)箱(德國賀利氏產(chǎn)品)，超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，臺式離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，恒溫水浴箱(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)。

2 實驗方法

2.1 六味地黃丸藥液的制備 取六味地黃丸120丸加純凈水約300 mL，攪拌，超聲使之完全溶解后，添加純凈水至375 mL，使其藥液濃縮至2.0 g/mL，供實驗用。

2.2 含藥血清的制備 取SD大鼠20只，隨機分為2組，每組10只，♀♂各半，禁食不禁水12 h，第1組以六味地黃丸30 g/kg的劑量灌胃給藥，每天3次，連續(xù)3 d，于第3天最后一次給藥后1 h，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)肝門靜脈取血5 mL，第2組作為空白對照組灌以等量的水，操作同上，所有兩個組取血后靜置4 h，1 500 r/min離心30 min，取上清液，分裝，-20℃冷凍保存。實驗前將第1組含藥血清以增殖培養(yǎng)液配成終濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)液，即低、中、高不同劑量組。(終濃度=加入的血清體積/總體積×100%)。

2.3 大鼠前脂肪細胞的培養(yǎng) 取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒，pH 7.2緩沖生理鹽水(PBS)洗滌后剪成0.5～1 mm3大小均勻的小顆粒，以1 000 r/min離心10 min取上層的純脂肪顆粒，輕輕地鋪于經(jīng)培養(yǎng)液潤濕的培養(yǎng)瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培養(yǎng)液5～10 mL，塞緊瓶塞，將底面翻轉(zhuǎn)朝上。37℃、5%CO2培養(yǎng)1～2 h，待黏附牢固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶做正常培養(yǎng)每日觀察。原代培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達到約1/2瓶底面積后即可傳代，取培養(yǎng)7代以內(nèi)的大鼠前脂肪細胞用于實驗。

2.4 分組、給藥 取傳代7代以內(nèi)的細胞分為空白大鼠血清組(簡稱空白組)、腎上腺素+空白大鼠血清組(簡稱腎上腺素組)、六味地黃丸含藥血清高劑量組(簡稱丸高組)、六味地黃丸含藥血清中劑量組(簡稱丸中組)，六味地黃丸含藥血清低劑量組(簡稱丸低組)、六味地黃丸含藥血清+腎上腺素組(簡稱含腎藥物組)，空白組和六味地黃丸高、中、低組分別加入2.2項所制備的相對應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)液，含腎空白組以及含腎藥物組先分別加入10 nmol/L的腎上腺素血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換2.2項所制備的相對應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)液。六味地黃丸含藥血清于細胞傳代后立即給予，待培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達到約1/2瓶底面積后加入腎上腺素。

2.5 細胞內(nèi)cAMP水平的檢測 取第六代大鼠前脂肪細胞以2×105個/mL的濃度傳于50 mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)至生長旺盛時，棄培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)48 h，收集細胞，用pH4.75的醋酸緩沖液懸浮，調(diào)整濃度至106個/mL，取1 mL細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，使細胞沉淀，棄去上清液，細胞沉淀加1 mL pH4.75的醋酸緩沖液混懸，反復(fù)凍融3～4次，3 000 r/min離心15 min。取上清液100 μL按所購“cAMP測定放射免疫分析試劑盒”使用說明書進行測定。利用cAMP與125I-cAMP和特異性蛋白激酶競爭結(jié)合原理測定細胞內(nèi)cAMP的濃度，GC-1200 r放射免疫計數(shù)器上測定放射性強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出細胞內(nèi)cAMP含量。將實驗數(shù)據(jù)進行成組t檢驗，統(tǒng)計學(xué)處理。

3 結(jié)果

六味地黃丸對腎上腺素誘導(dǎo)大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP的影響，結(jié)果見表1

表1 對腎上腺素誘導(dǎo)大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP的影響

表1所示:腎上腺素組與空白組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，提示腎上腺素能明顯使大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP含量升高;丸劑各劑量組與空白組比較，六味地黃丸中劑量組和高劑量組有顯著性差異，提示丸劑中劑量和高劑量含藥血清均能使大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP水平降低，低劑量對大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP水平?jīng)]有影響;含腎藥物組與腎上腺素組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，提示六味地黃丸能降低腎上腺素使細胞內(nèi)cAMP水平升高的作用。同時，含腎藥物組與空白組比較，沒有顯著性差異，進一步說明在腎上腺素使細胞內(nèi)cAMP水平升高后，六味地黃丸含藥血清能使細胞內(nèi)cAMP含量恢復(fù)到正常水平。

總之，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸含藥血清各濃度對大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP水平均有降低的作用;六味地黃丸能拮抗腎上腺素升高大鼠前脂肪細胞內(nèi)的cAMP水平的作用，并使其cAMP含量恢復(fù)到正常水平。由于腎上腺素對細胞內(nèi)cAMP的作用是通過激動細胞膜表面β受體途徑達到的，因此，六味地黃丸對細胞內(nèi)cAMP的影響也可能是由于阻斷細胞膜表面β受體途徑而產(chǎn)生的。

4 討論

原代脂肪細胞培養(yǎng)(primary fat cell culture)是指用膠原酶消化，將得到的脂肪細胞作體外培養(yǎng)［3］。目前國內(nèi)外前脂肪細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)大致有兩類，一類來源于血管基質(zhì)組份細胞(stromal vascular fraction，SVF)，這是經(jīng)典的前脂肪細胞。此外，近年還有人報道采用脂肪組織塊貼壁和天花板培養(yǎng)相結(jié)合的方法并獲得了成功［4］。在本實驗中，我們采用脂肪組織塊貼壁和天花板培養(yǎng)相結(jié)合的方法對大鼠皮下脂肪的前脂肪細胞進行原代培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出了大鼠前脂肪細胞，并且生長良好。

離體培養(yǎng)細胞是從細胞水平研究藥物機制較為理想的體外模型。同時由于中藥多屬粗制劑，如果直接加入細胞培養(yǎng)體系，其中的雜質(zhì)、電解質(zhì)及酸堿度等都會對細胞產(chǎn)生影響，從而干擾實驗結(jié)果。本實驗應(yīng)用血清藥理學(xué)方法可在某種程度上克服上述干擾，不僅反映藥物可吸收部分的直接作用，通過對照，也可反映藥物在機體作用下形成的代謝物誘生的機體內(nèi)源性物質(zhì)的影響，且更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程。

cAMP是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，由三磷酸腺苷(ATP)在腺苷環(huán)化酶(AC)催化下生成。細胞內(nèi) cAMP增多，能激活 cAMP依賴性蛋白激酶 A(APK)，使細胞內(nèi)許多蛋白酶磷酸化而使之活化，從而調(diào)節(jié)代謝，產(chǎn)生生理效應(yīng)［5］。不少實驗資料也表明，當(dāng)cAMP發(fā)生含量變化時，細胞的功能也隨之發(fā)生明顯變化［6］。隨著細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)研究的深入，通過調(diào)控細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)來研究六味地黃方已倍受關(guān)注。

六味地黃方乃滋陰補腎之名方，同時該方還具有抗癌、增強細胞免疫性、調(diào)節(jié)血壓、血脂等方面的作用［7-8］。近年來對該方的研究比較多，也研究的比較深刻，目前研究六味地黃方對cAMP信使的報道不多，而且大部分基于陰虛血液中cAMP含量的研究，有人報道［4］了對氫考I型法復(fù)制腎陰虛小鼠服用六味地黃沖劑，顯示小鼠血漿中的cAMP含量較未服藥腎陰虛組小鼠明顯降低。目前研究該方對細胞內(nèi)cAMP含量的報道甚少，而cAMP信使系統(tǒng)是細胞內(nèi)一個重要的信息傳導(dǎo)通路，具有多種生理及病理作用，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細胞增殖分化，維持平滑肌舒縮平衡和血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，參與神經(jīng)活動，調(diào)控基因表達等方面居重要地位［9］。隨著研究的深入，其在臨床治療學(xué)中的意義也日益凸顯。本實驗研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能明顯降低大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP的含量，而六味地黃方自古被認為是滋陰的良方，所以研究六味地黃丸滋陰作用是否是通過改變細胞內(nèi)cAMP的含量而達到的，甚至該方的其他藥理作用是否與細胞內(nèi)cAMP水平及其信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，對我們進一步加深對該方藥理作用本質(zhì)的認識產(chǎn)生積極作用。

腎上腺素是腎上腺髓質(zhì)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，它是α、β受體激動藥，它能通過激動β受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)cAMP水平升高。實驗發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有降低大鼠前脂肪細胞內(nèi)cAMP水平的作用。本實驗結(jié)果表明，當(dāng)腎上腺素與六味地黃丸聯(lián)合使用時，細胞內(nèi)cAMP水平與正常時相比較沒有顯著差異，表明六味地黃丸能拮抗腎上腺素降低細胞內(nèi)cAMP水平的作用，而腎上腺素本身能通過激動β受體使細胞內(nèi)cAMP水平升高，六味地黃丸對腎上腺素的拮抗作用究竟是否完全是通過阻斷細胞膜上β受體來達到的，仍需更深入的研究。

［1］肖子曾，戴 冰，黃開顏，等.六味地黃湯對小鼠血漿中環(huán)核苷酸的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2004，10(1):44-46.

［2］孫京華，王凈信，劉常明，等.腎上腺素對視網(wǎng)膜色素上皮細胞ATP酶活性及細胞內(nèi)cAMP和鈣離子濃度的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報，2006，35(3):392-395.

［3］夏 蓉，楊耀琴，楊虎川.脂肪細胞和前脂肪細胞培養(yǎng)的研究進展［J］.同濟大學(xué)學(xué)報，2003，24(3):249-251.

［4］朱曉海，何清濂，林子豪.人前脂肪細胞培養(yǎng)及增殖與分化模型的建立［J］.中華整型燒傷外科雜志，1999，15(3):199-201.

［5］夏宗勤，朱 玟，胡雅兒，等.中醫(yī)“虛證”理論的初步探討［J］.中醫(yī)雜志，1979，11(2):2-10.

［6］遲素敏，李承新，劉亞莉，等.ACh對人垂體腺瘤細胞內(nèi)蛋白激酶C、胞內(nèi)游離鈣及cAMP/cGMP的影響［J］.生理學(xué)報，2003，55(2):165-170.

［7］宗麗麗，張 瑜，張大祿.六味地黃方的免疫、抗腫瘤藥理研究［J］.中成藥，2001，23(12):910-913.

［8］徐 速，梅春燕.六味地黃方實驗研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2003，14(5):312-313.

［9］陳 敏，余江平，黃 敏.環(huán)核苷酸的生理作用及臨床應(yīng)用［J］.中國藥房，2007，18(11):872-874.