劉曉丹，楊剛，范秋靈，劉楠，栗霄立，馮江敏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110001）

自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠腎臟損害的特征與演變

劉曉丹，楊剛，范秋靈，劉楠，栗霄立，馮江敏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110001）

目的觀察自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠糖尿病早期腎損害的特征和演變，旨在探討其在糖尿病腎病研究中的應(yīng)用價值。方法 選擇8周齡雄性KKAy小鼠和C57BL/6小鼠各20只，分別于8周齡、20周齡測定血糖、尿微量白蛋白、尿肌酐，并留取腎臟標(biāo)本，于光鏡及電鏡下觀察其腎臟病理特點。結(jié)果 不同周齡KKAy小鼠體質(zhì)量、隨機血糖均高于對照組C57BL/6小鼠（P<0.05）。20周齡KKAy小鼠尿白蛋白排泄率顯著高于8周齡KKAy小鼠和對照組C57BL/6小鼠（P<0.05）。20周齡KKAy小鼠光鏡下腎小球面積增大，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，可見硬化結(jié)節(jié)；電鏡下腎小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合。結(jié)論20周齡KKAy小鼠出現(xiàn)肥胖、高血糖、尿白蛋白排泄率增加及典型的糖尿病腎病病理改變，是研究2型糖尿病早期腎損害的理想動物模型。

KKAy小鼠；糖尿病腎病；動物模型；腎臟病理損害

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病腎病發(fā)病隱匿，早期以微量蛋白尿為唯一表現(xiàn)，如未早期發(fā)現(xiàn)及控制，持續(xù)進展將形成大量蛋白尿，最終引起腎功能不全，給患者和社會帶來巨大的醫(yī)療壓力和沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［1］。人源標(biāo)本的不足、遺傳背景的復(fù)雜性和不可控性是長期以來困擾人類疾病研究的難題。以模型動物代替人體實驗是解決這一問題的常用方法，動物模型與人類疾病的相似程度是判斷該模型的重要指標(biāo)［2］。自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠以其更接近人類2型糖尿病腎病早期病變的特點，正逐步引起人們的關(guān)注。本文觀察自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠腎臟損害的特征和演變，以證實該動物模型在糖尿病腎病早期病變研究方面的價值。

1 材料與方法

1.1 動物的分組及處理

SPF級雄性8周齡KKAy小鼠20只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，許可證號：SCXK（京）2005-0013；SPF級雄性8周齡C57BL/6小鼠20只，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，許可證號：SCXK（遼）2008-0005。飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部SPF級動物房，單籠飼養(yǎng)，溫度（23±3）℃，濕度50%±20%，每12h交替照明。KKAy小鼠給予高脂飲食（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所）；C57BL/6小鼠給予普通飼料。所有小鼠均自由進食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 體質(zhì)量：于8、12、16、20周齡應(yīng)用電子臺秤測定小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 隨機血糖檢測：于8、12、16、20周齡尾靜脈取血測血糖（德國羅氏樂康全血糖儀及試紙），隨機血糖≥13.9mmol/L確診為糖尿病。

1.2.3 尿微量白蛋白、尿肌酐檢測：于8周齡、20周齡采用提尾反射法收集KKAy小鼠和C57BL/6小鼠隨機尿液，采用ELASA試劑盒（購于美國RB公司）檢測尿微量白蛋白和尿肌酐，計算尿微量白蛋白/肌酐比率。

1.2.4 腎臟形態(tài)學(xué)觀察：分別于8周齡、20周齡處死小鼠后，立即留取腎臟皮質(zhì)，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，PAS染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。留取腎臟標(biāo)本2.5%戊二醛中固定，透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量的變化

隨著年齡的增長，KKAy小鼠和C57BL/6小鼠的體質(zhì)量均逐漸增加，KKAy小鼠8、12、20周齡的體質(zhì)量為（25.44±0.79）g、（36.37±1.1）g、（45.92±2.61）g，正常對照組C57BL/6小鼠的體質(zhì)量為（20.81±2.07）g、（24.68±1.67）g、（30.47±1.34）g。兩組間相應(yīng)周齡的體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 血糖的變化

KKAy小鼠于8、20周齡的平均隨機血糖為（19.94±5.34）mmol/L、（29.62±3.99）mmol/L，相應(yīng)周齡 C57BL/6小鼠平均隨機血糖為（10.65±1.40）mmol/L、（11.07±1.26）mmol/L。兩組間相應(yīng)周齡的隨機血糖差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 尿微量白蛋白/肌酐檢測結(jié)果

隨著年齡的增長，KKAy小鼠的尿微量白蛋白/肌酐比率逐漸增加。KKAy小鼠于8、20周齡的尿微量白蛋白/肌酐比率分別為（41.85±4.81）mg/g、（728±177.19）mg/g，相對應(yīng)周齡的C57BL/6小鼠的尿微量白蛋白/肌酐比率分別為（46.91±5.14）mg/g、（49.37±18.77）mg/g。20周齡 KKAy小鼠，尿微量蛋白/肌酐比率顯著高于8周齡KKAy小鼠和對照組C57BL/6小鼠（P<0.05）。

2.4 腎臟病理改變

20周齡KKAy小鼠腎臟體積增大，表面尚光滑，均可見腎盂擴張；20周齡對照組C57BL/6小鼠腎臟紅潤光滑，無腎盂擴張。光鏡下可見，8周齡、20周齡KKAy小鼠的腎小球面積均大于相應(yīng)周齡對照組；20周齡KKAy小鼠腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，可見硬化結(jié)節(jié)，腎小管基底膜增厚（見圖1、2）。電鏡下可見8周齡KKAy小鼠腎臟結(jié)構(gòu)基本正常；20周齡KKAy小鼠腎小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合（圖 3，4）。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，已經(jīng)引起了普遍關(guān)注。其發(fā)病可能與遺傳易感性、糖脂代謝紊亂以及腎小球血流動力學(xué)改變等因素有關(guān)。糖尿病腎病發(fā)病隱匿，早期診斷及治療對于逆轉(zhuǎn)疾病的進程至關(guān)重要，建立與人類2型糖尿病腎病早期病理改變相似的動物模型是深化研究的基礎(chǔ)［3］。

目前小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射結(jié)合高糖高脂飲食所誘發(fā)的2型糖尿病腎病動物模型，因其操作相對簡易，實驗成本較低，在研究中應(yīng)用較多［4～7］。但是給藥劑量及飲食干預(yù)的不一致性及藥物本身對腎臟的損傷，均對疾病研究的準(zhǔn)確性及連續(xù)性帶來了干擾。轉(zhuǎn)基因糖尿病腎病動物模型，其轉(zhuǎn)入致病基因明確，動物模型遺傳背景清楚，且接近人類糖尿病腎病臨床表型，為其應(yīng)用優(yōu)勢所在。但由于其對技術(shù)及操作水平的較高要求，目前應(yīng)用仍受到一定的限制。相對上述兩類動物模型而言，自發(fā)性動物模型具有遺傳信息完整，個體差異小，繁育時間短及實驗重復(fù)性好等優(yōu)點［8］。KK小鼠系能自發(fā)出現(xiàn)肥胖、高血糖及高胰島素血癥［9］。其編碼皮毛顏色信息的Agouti（a）基因位于小鼠2號染色體上，該基因為a/a純合子時，小鼠皮毛表達(dá)正常的黑色，當(dāng)出現(xiàn)黃色基因（yellow，y）變異為Ay/a雜合子時，小鼠皮毛呈現(xiàn)黃色，同時伴發(fā)肥胖、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂等代謝異常綜合征［10］。遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了KKAy小鼠糖尿病的發(fā)生，與人類2型糖尿病極其相似［11］。

本研究觀察到，以隨機血糖≥13.9mmol/L作為小鼠糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，大部分KKAy小鼠于8周齡發(fā)生糖尿病，但尿微量白蛋白排泄水平正常，腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，尚未發(fā)生腎臟損害。20周齡時，血糖進一步升高，體質(zhì)量明顯高于對照組，隨機尿液中尿微量白蛋白排泄水平與尿肌酐的比率（反映24h尿白蛋白排泄水平）顯著高于對照組，與本課題組［12］關(guān)于KK系KK/Ta小鼠的研究結(jié)果相近。病理研究發(fā)現(xiàn)，20周齡KKAy小鼠光鏡下可見腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，伴硬化結(jié)節(jié)，電鏡下可見腎小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合，符合糖尿病腎病早期典型的病理改變，此觀察結(jié)果與陳麗萌等［13］相關(guān)研究結(jié)果一致。

綜上所述，自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠，8周齡時血糖水平顯著升高，20周齡時尿白蛋白排泄量顯著增加，腎臟病理改變與人類糖尿病腎病相似，是研究2型糖尿病早期腎臟損害的理想動物模型。

［1］Atkins RC，Zimmet P.Diabetic kidney disease：act now or pay later［J］.Kidney Int，2010，77（5）：375-377.

［2］Leiter EH.Selecting the‘right’mouse model for metabolic syndrome and type 2diabetes research［J］.Methods Mol Biol，2009，560：1-17.

［3］Baribault H.Mouse models of typeⅡdiabetes mellitus in drug discovery［J］.Methods Mol Biol，2010，602：135-155.

［4］張浩軍，趙靜波，李平.糖尿病腎病動物模型研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24（7）：845-848.

［5］趙保勝，董淑云，霍海如，等.2型糖尿病動物模型的研究進展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2005，11（5）：62-66.

［6］田愛平，郭賽珊，陳躍騰，等.高熱量飼料誘發(fā)胰島素抵抗動物模型的實驗研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（11）：827-831.

［7］黃桂紅，賀敏，黃仁彬.鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠模型的建立及抗氧化能力的影響［J］.中國藥事，2009，23（8）：755-757.

［8］萬玉玲，劉曉明.自發(fā)性2型糖尿病動物模型［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（14）：2175-2177.

［9］陳其明，史順娣，申竹芳，等.糖尿病KK小鼠生物特性的研究［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，1988，10（6）：416-420.

［10］Bazhan NM，Makarova EN.The effect of the ‘yellow’mutation at the mouse agouti locus on the hormonal profile of pregnancy and lactation ［J］.Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova，2009，95（11）：1254-1257.

［11］郭清華，陸菊明，潘長玉.飲食能量對Kkay及Kk小鼠2型糖尿病發(fā)病的影響［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2005，26（2）：140-142.

［12］Fan QL，Shike T，Shigihara T，et al.Gene expression profile in diabetic KK/Ta mice［J］.Kidney Int，2003，64（6）：1978-1985.

［13］陳麗萌，李學(xué)旺，黃利偉，等.2型糖尿病小鼠（KKAy）動物模型的鑒定和早期腎臟病理改變［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2002，24（1）：71-75.

（編輯裘孝琦，英文編輯王又冬）

Renal Impairment in KKAy Mice with Spontaneous Type 2Diabetes

LIU Xiao-dan，YANG Gang，F(xiàn)AN Qiu-ling，LIU Nan，LI Xiao-li，F(xiàn)ENG Jiang-min
（Department of Nephrology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the early renal impairment in KKAy mice with spontaneous type 2diabetes.MethodsBlood glucose，urinary microalbumin and urinary creatinine of twenty male KKAy mice and twenty male C57BL/6mice were measured at the age of 8，20weeks respectively.The renal pathological changes were observed under light microscope and electron microscope.ResultsKKAy mice developed higher body weight and blood glucose than C57BL/6mice at all the different ages （P<0.05）.Urinary microalbumin/creatinine ratio in 20-week-age KKAy mice was higher than that in 8-week-age KKAy mice and C57BL/6mice （P<0.05）.Pathological lesions in 20-week-age KKAy mice were increasing of glomerular area，thickening of glomerular basement membrane，expansion of mesangial matrix，with sclerosis lesions under light microscope；thickening of basement membrane and fusion of foot processes were evident under electron microscope.ConclusionKKAy mice developed obesity，hyperglycemia，albuminuria and typical pathological lesions of diabetic nephropathy at 20weeks of age.Therefore，KKAy mice may serve as a suitable model for the study of type 2diabetes and early stage diabetic nephropathy in humans.

KKAy mice；diabetic nephropathy；animal model；renal pathological lesions

R587.2

A

0258-4646（2011）02-0104-03

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0949.001

國家自然科學(xué)基金資助項目（30700369）；留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項目（教外司留［2006］331號）；遼寧省教育廳高?？蒲杏媱濏椖浚↙2010658）

劉曉丹（1977-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.

范秋靈，E-mail：cmufql@163.com

2010-11-06