趙詩萌，吳紅敏，張良，張玲

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，沈陽 110001；2.遼河油田中心醫(yī)院兒科，遼寧 盤錦 124010）

E2F1基因在CLD新生鼠肺成纖維細(xì)胞中的動態(tài)表達(dá)及意義

趙詩萌1，吳紅敏1，張良1，張玲2

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，沈陽 110001；2.遼河油田中心醫(yī)院兒科，遼寧 盤錦 124010）

目的通過檢測E2F1基因在高氧致早產(chǎn)兒慢性肺疾?。–LD）新生鼠肺成纖維細(xì)胞中的動態(tài)表達(dá)，初步探討E2F1基因在CLD肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用。方法 足月新生SD大鼠于生后12h內(nèi)分別持續(xù)吸入85%高氧和空氣，于3、7、14、21d隨機(jī)處死動物后，無菌條件下采集肺組織，進(jìn)行肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，免疫組化、Western blot法檢測E2F1蛋白表達(dá)，real-time PCR法檢測E2F1mRNA含量。結(jié)果 生后3d空氣組和高氧組E2F1蛋白及mRNA的表達(dá)（蛋白：0.251±0.054，0.249±0.074；mRNA：0.0664±0.0034，0.0668±0.0037）無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；生后 7d 時高氧組 E2F1蛋白及 mRNA的表達(dá)較空氣組增加（蛋白：0.248±0.041，0.278±0.034；mRNA：0.0659±0.0031，0.0728±0.0047），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；14d、21d 時增加明顯 （蛋白：0.243±0.077vs 0.328±0.057，0.241±0.038vs 0.377±0.063；mRNA：0.241±0.038vs 0.377±0.063，0.0655±0.0038vs 0.0750±0.0041，P<0.01）。結(jié)論E2F1異常高表達(dá)參與了高氧致CLD鼠肺成纖維細(xì)胞過度增殖的病理過程，在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

高氧；早產(chǎn)兒慢性肺疾??；E2F1基因；肺成纖維細(xì)胞

隨著早產(chǎn)兒，尤其是極低出生體質(zhì)量兒存活率的明顯提高，因長時間吸入高濃度氧所導(dǎo)致的早產(chǎn)兒慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD）已成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾?。?］。早產(chǎn)兒CLD的晚期病理結(jié)局是肺間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)為肺成纖維細(xì)胞（lung fibrolasts，LFs）過度增殖［2，3］，其細(xì)胞水平的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。E2F1基因是細(xì)胞周期G1期向S期過渡的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1基因的過表達(dá)能刺激細(xì)胞增殖，而E2F1基因與肺間質(zhì)纖維化之間是否存在著某種關(guān)系，目前尚未見報道。本研究通過對CLD新生鼠不同發(fā)展階段肺成纖維細(xì)胞中E2F1蛋白及mRNA的動態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行檢測，探討其與肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠2～3月齡，雌性40只，雄性10只，體質(zhì)量210～260g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物部提供。大鼠E2F1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。通用型SP系列工作液試劑盒（SP-9000）、DAB顯色劑及堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉生物公司。SYBR（R）ExScriptTMRT-PCR Kit擴(kuò)增試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組：將足月新生SD大鼠隨機(jī)分為空氣組和高氧組。高氧組于生后12h內(nèi)（連同母鼠）置于玻璃氧箱（60cm×50cm×40cm）中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2在85%，用鈉石灰吸收CO2，使其濃度<0.5%。溫度22～25℃，濕度50%～70%，每天定時開箱30min，添加水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以免因氧中毒而導(dǎo)致喂養(yǎng)能力下降。空氣組置于同一室內(nèi)空氣中（FiO2=21%），飼養(yǎng)條件與高氧組相同。

1.2.2 肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：分別于實驗后3、7、14、21d處死動物后，無菌條件下采集肺組織，進(jìn)行LF的原代培養(yǎng)，方法同文獻(xiàn)［5］。待細(xì)胞鋪滿瓶底后按1︰2傳代，收集第3代細(xì)胞用于實驗。

1.2.3 免疫組化技術(shù)檢測E2F1蛋白表達(dá)：取同代細(xì)胞接種于蓋玻片上，第2日取出蓋玻片用4%多聚甲醛固定。3%H2O2室溫孵育10min，山羊血清工作液室溫封閉20min后，加大鼠E2F1單克隆抗體（1︰50），4℃濕盒過夜。滴加生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1︰200）15min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液15min，DAB顯色。顯微鏡下觀察并拍片，隨機(jī)抽取每組動物各時間點培養(yǎng)的LF免疫組化爬片10張，每張爬片于光鏡下（×400）隨機(jī)取5個視野，應(yīng)用美國Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)半定量測定，應(yīng)用Meta Morph軟件分析陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，以平均積分光密度值表示E2F1產(chǎn)物的強(qiáng)度、光密度值與陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)強(qiáng)度成正比。

1.2.4 Western blot法檢測E2F1蛋白表達(dá)情況：從液氮中取出凍存的標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，酚試劑法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜。一抗為小鼠E2F1單克隆IgG抗體，4℃過夜，二抗（抗鼠，IgG，北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品）37℃孵育2h，顯色，觀察結(jié)果。以β-actin蛋白為內(nèi)參，采用GIS-2020凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果，對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行密度分析，以相對灰度值代表蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.5 Real-time PCR法檢測E2F1mRNA水平：取各實驗組細(xì)胞，RNAiso法提取總RNA，RT反應(yīng)按說明書進(jìn)行。以獲取的cDNA為模板，應(yīng)用Rotor-Gene2000熒光定量PCR儀，采用SYBR誖ExScriptTMRT-PCR 擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa，DRR053S）進(jìn)行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)按說明書步驟進(jìn)行。引物如下：E2F1正義鏈為 5′CCAGGAGTGAGTCAGCAGC 3′，反義鏈為 5′CACCTCCCTCCACATCCC 3′，GAPDH 正義鏈為 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 3′，反義鏈為 5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGT 3′。反應(yīng)條件：95℃ 10s，95℃5s，60℃20s，40個循環(huán)，融解曲線反應(yīng)條件：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。同時檢測 E2F1及GAPDH表達(dá)水平。E2F1mRNA的相對表達(dá)量=E2F1基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺成纖維細(xì)胞的E2F1的蛋白表達(dá)

免疫組化的結(jié)果顯示，E2F1主要在LF的細(xì)胞核中表達(dá)。生后3d時兩組E2F1蛋白的表達(dá)無明顯差異（P>0.05），生后7d時高氧組表達(dá)開始增多（P<0.05），14d、21d 時明顯增多（P<0.01）。Western blot法的檢測結(jié)果與免疫組化的結(jié)果一致。見表1、圖1及圖2。

表1各組L F s的E 2F 1蛋白表達(dá)免疫組化半定量分析（±s，n=10）T a b.1D y n a mi c e x p r e s s i o n o f E 2F 1i n L F s d e t e c t e d b y i mmu n o h i s t o c h e mi s t r y（±s，n=10）Group Day 3 Day 7 Day 14 Day 21Room air 0.251±0.054 0.248±0.041 0.243±0.077 0.241±0.038Hyperoxia 0.249±0.074 0.278±0.0341） 0.328±0.0572） 0.377±0.0632）1）P<0.05，2）P<0.01vs room air group.

2.2 E2F1mRNA的表達(dá)

生后3d，高氧組與空氣組E2F1mRNA的表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）；生后7d時，高氧組E2F1的表達(dá)量開始增加（P<0.05）；14d、21d時明顯增加（P<0.01）。見圖 3。

3 討論

研究表明，早產(chǎn)兒CLD晚期最主要的病理變化是肺間質(zhì)纖維化，其結(jié)局為肺成纖維細(xì)胞的大量聚集和膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的過多沉積，主要表現(xiàn)為過度增殖的肺成纖維細(xì)胞沉積于肺間質(zhì)或替代正常的肺上皮。細(xì)胞增殖在器官生長發(fā)育、損傷后的組織重建中發(fā)揮著重要作用，而細(xì)胞過度增殖則會導(dǎo)致異常的病理過程，給機(jī)體造成損害。因此，如何適時而又適度調(diào)控LFs的增殖，使之既不影響組織的修復(fù)，又不因增殖過度而纖維化，成為有效治療肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵。解決這一難題首先要從細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的研究著手。

E2F1基因是誘導(dǎo)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期最重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如PCNA，C-myc，DHFR，B-myb等）的表達(dá)來控制細(xì)胞周期的進(jìn)程［6］。在G1期中，cyclinD與CDK4結(jié)合，導(dǎo)致其活化，活化的CDK4可使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）易感基因的蛋白產(chǎn)物磷酸化，失去抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F1的作用，E2F1脫離Rb蛋白后激活并啟動DNA合成，細(xì)胞繼而越過G1/S控制點進(jìn)入S期［7］。E2F1基因過表達(dá)能刺激細(xì)胞增殖。在人類很多腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E2F1的過表達(dá)加快了細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化，腫瘤形成［8～10］。在非腫瘤細(xì)胞的異常增殖過程中，E2F1基因也起著重要的作用。謝慶祥等［11］證實，E2F1基因參與了腎間質(zhì)細(xì)胞增殖過程，尤其與腎纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。張懷軍等［12］通過對正常皮膚、正常瘢痕組織和病理性瘢痕組織的E2F1的基因水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，E2F1基因在病理性瘢痕組織中表達(dá)增高，對瘢痕組織中細(xì)胞的增殖起著重要的作用。

我們在前期對高氧CLD鼠肺病理形態(tài)學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，吸入85%的氧7d時，CLD鼠的肺組織開始出現(xiàn)纖維化的改變，14d時纖維化改變明顯，21d時達(dá)到高峰［13］；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，隨著高氧暴露時間的延長，LFs處于G1期細(xì)胞的比例逐漸減少，S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例則無明顯差異，說明高氧使肺成纖維細(xì)胞G1/S調(diào)控點的作用減弱［3］。本研究結(jié)果顯示，自高氧暴露7d起，高氧組LFs的E2F1mRNA及蛋白的表達(dá)較空氣對照組升高，且隨著高氧暴露時間的延長，升高的趨勢愈加明顯，21d時達(dá)到高峰。說明高氧可使肺成纖維細(xì)胞中E2F1基因的表達(dá)增加，且其增加的程度與高氧暴露的時間呈正相關(guān)。E2F1的過表達(dá)使肺成纖維細(xì)胞G1/S調(diào)控點的作用減弱，更多的細(xì)胞越過了G1/S調(diào)控點，由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA復(fù)制，肺成纖維細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致肺間質(zhì)的纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子E2F1在CLD肺纖維化肺成纖維細(xì)胞的過度增殖中起著重要的作用，對研究CLD肺纖維化形成的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

［1］Bancalari E.Bronchopulmonary dysplasia：old problem，new presentation［J］.J Pediatr（Rio J），2006，82（1）：2-3.

［2］Jobe AH，Bancalari E.Bronchopulmonary dysplasia［J］.Am J Respir Crit Care Med，2001，163（4）：1723-1729.

［3］趙詩萌，吳紅敏，劉雪雁，等.CLD鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及生物學(xué)行為研究 ［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（17）：2561-2564.

［4］Johnson DG，Schwarz JK，Cress WD，et al.Expression of transcription factor E2F1induce squiescent cells to enter S phase ［J］.Nature，1993，365（6444）：349-352.

［5］Michael D，Kelleher，Edward T，et al.In vivo hyperoxic exposure increase cultured lung fibroblast proliferation and c-Ha-ras expression［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1995，12（1）：19-26.

［6］Weinberg RA.E2F and cell proliferation：a world turned up-side down［J］.Cell，1996，85（4）：457-459.

［7］徐全，張平，劉勇.細(xì)胞周期調(diào)控因子P16和CDK4在肺癌中的表達(dá)［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，44（4）：16-21.

［8］Stanelle J，Stiewe T，Theseling CC，et al.Gene expression changes in response to E2F1activition ［J］.Nucleic Acides Res，2002，30（8）：1859-1867.

［9］Han S，Park K，Bae BN，et al.E2F1expression is related with the poor survival of lymph node-positive breast patients treated with fluorouracil，doxorubicin and cyclophosphamide［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，82（1）：11-16.

［10］Eymin B，Gazzeri S，Brambila C，et al.Distinct pattern of E2F1expression in human lung tumours：E2F1is upregulated in small cell lung carcinomal［J］.Oncogene，2001，20（14）：1678-1687.

［11］謝慶祥，林嚇聰，韓聰祥.轉(zhuǎn)錄因子E2F-1在梗阻性腎組織中的表達(dá)及其意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（7）：871-873.

［12］張懷軍，李桑蕾，張磊，等.病理性瘢痕組織中E2F1基因的表達(dá)及其意義［J］.實用診斷與治療雜志，2007，17（3）：187-189.

［13］劉雪雁，趙詩萌，薛辛東.MMP-9和TIMP-1在新生大鼠持續(xù)高氧暴露后肺組織中的動態(tài)表達(dá)［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，36（5）：502-504.

（編輯王又冬，英文編輯王又冬）

Dynamic Expression ofE2F1Gene in Lung Fibroblasts of Neonatal Rats with CLD

ZHAO Shi-meng1，WU Hong-min1，ZHANG Liang1，ZHANG Ling2
（1.Department of Neonatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pediatrics，The Central Hospital of Liaohe Oil Field，Panjin 124010，China）

ObjectiveTo determine the dynamic expression ofE2F1gene in lung fibrolasts of neonatal rats with chronic lung disease（CLD），and to elucidate the biological effects ofE2F1in pulmonary interstitial fibrosis of CLD.MethodsFull-term newborn SD rats were continuously exposed to 85%oxygen（hyperoxia group）or room air（room air group）within 12hours after birth.The rat pups were randomly selected to be killed on postnatal day 3，7，14and 21，lungs were immediately resected under sterile condition and primary culture of lung fibrolasts was performed.The expressions of E2F1protein and mRNA in lung fibrolasts were determined by immunohistochemistry，Western blot and Real-time PCR，respectively.ResultsNo significant difference in the expressions of E2F1protein and mRNA was found between hyperoxia and room air groups on postnatal day 3（protein：0.251±0.054vs 0.249±0.074；mRNA：0.0664±0.0034vs 0.0668±0.0037，P>0.05）.Compared with room air groups，the expression of E2F1in hyperoxia groups began to decrease since postnatal day 7（protein：0.248±0.041vs 0.278±0.034；mRNA：0.0659±0.0031vs0.0728±0.0047，P<0.05）and significantly decreased on postnatal day 14and 21（protein：0.243±0.077vs 0.328±0.057，0.241±0.038vs 0.377±0.063；mRNA：0.241±0.038vs 0.377±0.063，0.0655±0.0038vs 0.0750±0.0041，P<0.01）.ConclusionAbnormality of E2F1expression is involved in the pathological process of the proliferation of lung fibroblasts in hyperoxia-induced neonatal rats CLD and plays an important role in lung fibrosis.

hyperoxia；chronic lung disease；E2F1gene；lung fibrolast

R563

A

0258-4646（2011）02-0109-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.003

遼寧省教育廳高校科研計劃項目（2010599）

趙詩萌（1972-），女，講師，博士.

吳紅敏，E-mail：WHM406@163.com

2010-11-15