何培孝 王偉娜 楊利紅

雌呋栓微生物限度檢查方法的建立

何培孝 王偉娜 楊利紅

目的建立雌呋栓的微生物限度檢查方法。方法 按照《中國藥典》2010年版附錄的要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，控制菌檢查采用常規(guī)法。結(jié)果細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌檢查中，各陽性試驗(yàn)菌均檢出，陰性對照無菌生長。結(jié)論該法可消除雌呋栓的抑菌作用，適用于該制劑的微生物限度檢查。

雌呋栓;微生物限度檢查;方法學(xué)驗(yàn)證

雌呋栓用于女性缺乏雌激素、子宮嚴(yán)重萎縮、慢性陰道炎及老年性陰道炎等疾病的治療。為有效控制藥品的質(zhì)量，保證微生物限度檢查方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者根據(jù)《中國藥典》2010年版［1］附錄微生物限度檢查的新要求，對雌呋栓進(jìn)行了微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基與試劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、無菌十四烷酸異丙酯。以上均由中國食品藥品檢定院提供。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］、大腸埃希氏菌［CMCC(B)44 102］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98 003］。以上均由中國食品藥品檢定院提供。

1.3 樣品 雌呋栓，哈爾濱某醫(yī)院提供(批號為20101228、20101229、20101230)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮斜面培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，在23～28℃培養(yǎng)24 h，分別取上述培養(yǎng)液用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍依次稀釋至濃度約為50～100cfu/ml備用。取黑曲霉菌新鮮斜面培養(yǎng)物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液［2］適量將孢子洗下，并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至濃度約為50～100cfu/ml，備用。

2.2 供試液的制備 取本品10 g，加至含20 ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器內(nèi)，置40～45℃保溫，充分振搖使溶解，加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，萃取5～10 min，靜止，取水層作為1：10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 取1：10供試液1 ml，分別等量加入5個(gè)平皿中(每皿0.2 ml)，加入各試驗(yàn)菌1 ml，加入相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)，計(jì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)(n=3)。

2.3.2 菌液組 吸取上述稀釋的陽性菌菌液各1 ml至平皿中，立即傾入相應(yīng)的培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)，計(jì)各陽性菌的菌落數(shù)(n=3)

2.3.3 供試品對照組 測定樣品本底的菌數(shù)，方法同試驗(yàn)組，不加陽性對照菌(n=3)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取試驗(yàn)用稀釋劑代替供試液測定，方法同試驗(yàn)組(n=3)。

2.3.5 回收率結(jié)果 試驗(yàn)組菌回收率%=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。稀釋劑對照組菌回收率%=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%。平均回收率結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌方法驗(yàn)證的平均回收率(%)

從表1可以看出，5株試驗(yàn)菌的試驗(yàn)組菌回收率與稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，因此，可采用該法測定樣品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組 取2份1：10的供試液(每份10 ml)，分別接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基各500 ml中，再分別加入陽性對照菌金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌液各1 ml，置規(guī)定條件培養(yǎng);另取1：10的供試液10 ml，加膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml，再加入陽性對照菌銅綠假單胞菌液1 ml，置30 ～35℃培養(yǎng) 18～24 h。

2.4.2 陰性對照組 取等量稀釋劑，方法同試驗(yàn)組(不加陽性對照菌液)。

2.4.3 驗(yàn)證結(jié)果 試驗(yàn)組檢出陽性試驗(yàn)菌，陰性對照組無菌生長，見表2。

表2 控制菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

從表2看出該控制菌檢查方法適用于本品的檢查。

3 討論

3.1 雌呋栓為陰道用藥，按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法要求，增加了對白色念珠菌的檢查;

3.2 控制菌檢查中取消了陰性對照菌(大腸埃希氏菌)試驗(yàn)，取而代之以測定所用稀釋劑作為陰性對照組進(jìn)行試驗(yàn);

3.3 經(jīng)方法學(xué)試驗(yàn)，雌呋栓具有一定抑制微生物生長的作用，采用稀釋基稀釋法(細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查取五皿，每皿加樣0.2 ml;控制菌檢查培養(yǎng)基用量為500 ml)可有效去除樣品中的抑菌作用，為臨床用藥提供質(zhì)量保證。

［1］ 中國藥典.二部，2010：107-116.

［2］ 李云龍.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：400.

150001黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測所