戰(zhàn)大偉，李 靖，劉伯華，顏克松，戶 義，姜 濤，祝慶余

（1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100037；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬A型流感病毒，是分節(jié)段的負鏈單股RNA病毒。高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）是由以H5N1、H7N7為代表的H5和H7兩個亞型引發(fā)的疾病，對養(yǎng)禽業(yè)危害巨大，而且影響禽類產(chǎn)品的安全［1，2］。1997年香港首次發(fā)生H5N1禽流感病毒跨越種屬屏障感染人類并致死的事件，至今在全球范圍內(nèi)，高致病性H5N1亞型禽流感頻繁發(fā)生并造成人類感染，具有很高的致死率［3，4］，H5N1亞型禽流感作為人畜共患病的公共衛(wèi)生地位更加突出［5-7］。

H5N1禽流感病原學(xué)檢測的臨床與預(yù)防意義是早期診斷、確診，及時識別傳染源，盡早隔離與控制，因此應(yīng)用靈敏、特異和快速的檢測方法就顯得尤為重要。對于送檢的樣本及病料，目前實驗室常用檢測方法主要有傳統(tǒng)的細胞接種觀察 CPE法（cytopathic effect）、血凝實驗 （hemagglutination，HA）以及分子生物學(xué) RT-PCR、Real-time RT-PCR等［8-12］。本研究應(yīng)用 A/Beijing/01/03 H5N1病毒，雞胚擴增，蝕斑（plaque form ing unit，PFU）技術(shù)定量病毒滴度，應(yīng)用以上4種常用方法檢測稀釋的病毒懸液，比較檢測的最低稀釋度，比對檢測方法的靈敏性等特點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病毒與細胞

A/BeiJing/01/03為實驗室分離保存的高致病性H5N1禽流感毒株［13］；MDCK細胞株為本所細胞庫保存。實驗中具有感染性病毒粒子的操作均在在本所BSL-3實驗室內(nèi)進行。

1.1.2 試劑

RNA提取應(yīng)用 Rneasy Mini Kit，購自 QIAGEN公司；RT-PCR應(yīng)用 One-Step RT-PCR Kit，購自QIAGEN公司；Real-time RT-PCR應(yīng)用One-Step RTPCR Master M ix，購自 ABI公司；低溶點瓊脂糖，購自Invitrogen公司；雞血紅細胞及9日齡SPF雞胚，購自維通利華公司。

1.1.3 引物

RT-PCR及Real-time RT-PCR檢測H5N1病毒的HA基因保守區(qū)域［14］。RT-PCR檢測引物：上游引物：5’-CTCCCCTGCTCATTGCTATG-3’，下游引物：5’-GCCATTCCACAACATCCACCC-3’，擴增片斷長度為219 bp，引物由北京三博遠志生物技術(shù)公司合成。Real-time PCR檢測引物：上游引物：5’-ACATGCCCAAGACATACTGGAA-3’，下游引物：5’-GAATTCGTCACACATTGGGTTTC-3’，探針：FAMCACACAACGGGAAGCTCTGCGATCT-TAMRA，擴增片段長度為130 bp，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是 FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團 Non-fluorescent quencher和minor groove binder（MGB），由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖：將 H5N1病毒應(yīng)用 2％FBS DMEM 1∶100倍稀釋，經(jīng)絨毛尿囊腔接種法感染9日齡SPF雞胚，200μL/枚，石蠟溶化封口，37℃溫箱培養(yǎng)。每日照檢雞胚一次。挑出死亡雞胚，放置4℃冰箱過夜后收獲雞胚尿囊液，1000 r/min離心5 m in，上清分裝在細胞凍存管中，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒 PFU定量：采用雙層瓊脂糖法：應(yīng)用2％FBS DMEM維持液將病毒液10倍依次稀釋，每梯度吸取0.8 m L病毒液進行病毒蝕斑定量。應(yīng)用生長良好MDCK細胞（2×106個/mL）鋪6孔板，過夜培養(yǎng)。吸棄10％FBS DMEM培養(yǎng)液，換為 earle液，浸泡1 h后吸棄。將病毒稀釋液加入6孔板中，吸附1 h，加入第一層0.5％乳白蛋白水解物-犢牛血清營養(yǎng)低溶點瓊脂糖，1 m L/孔，待瓊脂糖充分凝固后放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中。48 h后加入含0.1％中性紅的第二層瓊脂糖染色，1 m L/孔，過夜培養(yǎng)，蝕斑觀察計數(shù)。

1.2.3 RNA提取：病毒核酸提取應(yīng)用 QIAGEN公司Rneasy Mini Kit，按試劑盒操作說明書進行。

1.2.4 病毒血凝實驗：向96孔血凝板各孔中加生理鹽水 0.25 m L，吸取0.25 m L病毒，加入第一孔中，與生理鹽水充分稀釋后吸0.25 m L加入第二孔中，依次2倍稀釋。每孔中加入1％雞紅細胞懸液0.25 m L，將血凝板放入濕盒中，室溫放置45 m in，觀察記錄實驗結(jié)果。

1.2.5 細胞接種：應(yīng)用生長良好的 MDCK細胞鋪96孔板，過夜培養(yǎng)。吸棄 10％FBS DMEM，根據(jù)PFU計數(shù)，首先用2％FBS DMEM稀釋病毒為10整數(shù)倍，然后10倍倍比稀釋的病毒液，每個梯度接種4孔，100 m L/孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日顯微鏡下觀察記錄細胞病變。

1.2.6 RT-PCR：50μL反應(yīng)體系：10μL 5×RTPCR緩沖液，2μL dNTP m ix，10μL 5×Q溶液，6 μL 5μmol/L上游引物，6μL 5μmol/L下游引物，2 μL酶混合液，0.5μL 20U/μl RNase抑制劑，9μL H2O，5μL模板 RNA。PCR參數(shù)：反轉(zhuǎn)錄50℃ 30 m in，起始 PCR反應(yīng)95℃ 15 min，三步循環(huán)：變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)數(shù)40；延伸72℃2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，80 V，40 min，凝膠成像。

1.2.7 Real-time RT-PCR：25μL反應(yīng)體系：5μL RNA，15μL 2×Taqman one-step RT-PCR混合液，0.75μL RNase抑制劑，終濃度為0.25μmol/L的上游引物、下游引物及終濃度為0.125μmol/L探針。反應(yīng)參數(shù)：逆轉(zhuǎn)錄48℃ 30 m in，起始反應(yīng)95℃ 10 m in，預(yù)變性，95℃ 15 s，60℃ 1 m in擴增40個循環(huán)。在60℃進行單點熒光檢測。

2 結(jié)果

2.1 待檢病毒定量

收獲得到含有大量感染性H5N1病毒粒子的雞胚尿囊液。A/BeiJing/01/03 H5N1病毒稀釋液在六孔板形成清晰的白色、大小不均一的混合病毒蝕斑，病毒滴度為2.25×107PFU/m L（彩插2圖1）。

2.2 靈敏性實驗結(jié)果

2.2.1 CPE觀察：高濃度病毒接種的MDCK細胞自48 h在顯微鏡能觀察到明顯病變，細胞發(fā)生融合，后期細胞變圓、崩解。至第5天，10-6病毒稀釋液接種的MDCK細胞病毒死亡，107稀釋的病毒接種細胞及對照細胞生長良好（彩插2圖2）。細胞接種方法檢出靈敏度至10 PFU/m L。

2.2.2 血凝實驗：2-1～2-6血凝結(jié)果為“4+”，2-7血凝結(jié)果為“3+”。雞血紅細胞血凝實驗?zāi)軌驒z出2-7病毒稀釋液，檢出靈敏度至3.52×105PFU/m L （彩插2圖3）。

2.2.3 RT-PCR檢測結(jié)果：10-1～10-4病毒稀釋樣本能夠清晰檢出特異性219 bp條帶，檢出靈敏度至103PFU/m L（圖4）。

圖4 RT-PCR檢測結(jié)果Fig.4 The Results of detection with one step RT-PCR

2.2.4 Real-time RT-PCR檢測結(jié)果：根據(jù)實驗室對熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的標(biāo)準(zhǔn)選擇與優(yōu)化，10-4，10-5為陽性，10-6為弱陽性結(jié)果，所以該方法能夠檢出10-6病毒稀釋液，檢出靈敏度至10 PFU/m L（圖5）。

3 討論

幾種檢測方法靈敏度比較：細胞接種與 Realtime RT-PCR病毒檢測靈敏度最高，能夠檢出 10 PFU/m L病毒粒子；RT-PCR能夠檢出103PFU/m L病毒粒子，檢測靈敏度比細胞CPE及Real-time RTPCR低 100倍；血凝實驗靈敏度最低，僅能檢出3.52×105PFU/m L病毒粒子。對于病毒含量較低的待檢樣本，細胞接種與Real-time RT-PCR是首選的檢測方法。

圖5 Real-time RT-PCR檢測結(jié)果Fig.5 The Results of detection with Real-time RT-PCR

幾種檢測方法檢測用時比較：細胞接種方法用時最長，高濃度病毒接種的敏感MDCK細胞也需要2 d才能夠觀察到顯著病變，低濃度病毒接種的細胞需要5 d出現(xiàn)病變，實驗前期細胞培養(yǎng)、材料處理等工作也需要一定時間；血凝實驗費時最短，能夠在2～3 h完成檢測；RT-PCR及 Real-time RT-PCR需要樣本處理、RNA提取等前期工作，但能夠在6～7 h得到結(jié)果。

不同的送檢樣本、采集方法、送檢條件及方式影響感染性H5N1病毒的存活，從而會直接細胞接種方法的檢出靈敏度。此外，傳統(tǒng)的細胞接種實驗及血凝實驗條件要求高，只能在BSL-3實驗室內(nèi)進行，實驗結(jié)果也需要尚需要如電鏡觀察或分子生物學(xué)方法進一步驗證。但是細胞接種檢測方法能夠同時分離獲得病原體，有利于病原學(xué)的進一步研究。

RT-PCR及Real-time RT-PCR等分子生物學(xué)方法應(yīng)用世界衛(wèi)生組織推薦的針對H5亞型HA基因保守序列檢測引物，實驗證明均具有高保真性［14］，用于檢測病毒核酸，對病原體要求低，只要有達到檢測下限的未降解AIV核酸即可，具有特異性，高度靈敏性，又檢測快速，而且簡便易操作，不需要高級別生物安全實驗室條件等保障條件，所以更適合于H5亞型禽流感病毒的快速診斷，因而分子生物學(xué)方法在H5N1禽流感的檢測中得以廣泛的應(yīng)用。RT-PCR產(chǎn)物能夠進行擴增片段的序列測定及序列比對分析，為流行病學(xué)調(diào)查研究提供重要數(shù)據(jù)。Real-time RT-PCR檢測技術(shù)，閉管式操作能夠最大程度避免污染與假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，還可以實現(xiàn)實時定量，適合用于病原體的早期快速診斷［15-17］。

綜上所述，將傳統(tǒng)的檢測手段與分子生物學(xué)方法結(jié)合，檢測中相互印證，能夠準(zhǔn)確、快速完成H5N1禽流感病原學(xué)檢測工作，為禽流感的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

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