竇建琳，張宏福，唐湘方

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，蘭州 730000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100093）

疾病動物模型的開發(fā)與應(yīng)用是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的基本保障，也是比較醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域。勝任動物模型是研究疾病發(fā)病機制的重要工具，也是研發(fā)和評價疫苗及藥物的重要實驗平臺。SARS、高致病性禽流感、甲型流感、登革熱、手足口病等新現(xiàn)病毒性疾病的爆發(fā)流行已成為了全球性的重大公共衛(wèi)生問題，而對于它們的研究都受到同一難題的制約：缺乏勝任疾病動物模型。

引起上述疾病的病毒以人為其重要或者唯一的自然宿主，非人靈長類動物于是就成為建模的首選。雖然有較為成功的案例［1］，但是非人靈長類動物的正常體溫高于人類的正常體溫，用以建模的溫度敏感突變株在人體內(nèi)無法增殖。另外，靈長類動物來源稀少，該類模型因而經(jīng)濟性欠佳，無法保障對其可重復(fù)性的驗證，并且與當(dāng)前重視保護動物權(quán)益的要求有所背離。

普通嚙齒類動物對于上述病毒的易感性較低，馴化病毒以提高毒力和通過對實驗動物進行基因操作以影響其疾病易感性是當(dāng)前的主流應(yīng)對策略［2］。人源化 NOD/SCID小鼠是研究發(fā)病機制和信號傳導(dǎo)的優(yōu)秀模型，但因其免疫功能缺陷，不能直接用于抗病毒藥物的藥效學(xué)研究和疫苗的評價。應(yīng)用基因敲除或者轉(zhuǎn)基因動物建模面臨的主要問題還有：靶點基因的篩選具有難度；易感性相關(guān)基因參與免疫、信號傳導(dǎo)、血管發(fā)生等功能，敲除可能具有致死性；敲除或轉(zhuǎn)基因動物建模特異性欠佳，可能會出現(xiàn)非特異病理變化。另外，基因敲除使靶基因的表觀遺傳機制難于研究，而宿主的表觀遺傳機制也是其病毒易感性的重要構(gòu)成部分［3］。

疾病動物模型最重要的特征是替代復(fù)制性［4］，即充分再現(xiàn)人類疾病的臨床表現(xiàn)和病理特征，并盡可能符合自然感染途徑及免疫狀態(tài)。符合上述特征的動物模型不僅有利于發(fā)病機制的研究，同時也是評價疫苗和抗病毒藥物的主要平臺。在普通嚙齒類動物構(gòu)建勝任的病毒感染模型不但是疾病防控的需求，也是動物實驗應(yīng)用中“3R”（reduction減少，replacement替代及 refinement優(yōu)化）原則的體現(xiàn)。

本文通過文獻回顧，認為營養(yǎng)干預(yù)可有助于在嚙齒類動物建立新現(xiàn)病毒的勝任感染模型；營養(yǎng)涵蓋范圍廣泛，本文著眼于維生素如維生素D及維生素A、微量元素如硒、錳及腸道菌群與宿主疾病易感性和病毒進化的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)解決相關(guān)難題的線索。

1 營養(yǎng)與宿主易感性

營養(yǎng)代謝性疾病可增加個體對病毒的易感性，1型糖尿病患者感染腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）、柯薩奇病毒等腸道病毒的風(fēng)險約是其它人群的10倍［5］；巧合的是，在NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠可構(gòu)建較為成功的EV71感染模型［6］。這提示宿主的營養(yǎng)狀態(tài)與其疾病易感性關(guān)系密切。

營養(yǎng)是宿主抵抗力的主要決定因素之一，營養(yǎng)不良通過削弱宿主的免疫防御功能，從而提高病毒感染的風(fēng)險［7］。蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核酸等參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育及正常免疫功能的維護［8］，因此這些基本營養(yǎng)成分的變化常導(dǎo)致普遍易感性上升。而維生素、微量元素、益生菌等特殊營養(yǎng)成分與特定的病毒易感性相關(guān)聯(lián)［9］。維生素 D的狀態(tài)與HIV的疾病進程有密切關(guān)聯(lián)［10］，提高活性維生素D的血清濃度可顯著減低急性呼吸道病毒感染的發(fā)病率［11］?？滤_奇病毒感染硒缺乏的動物可構(gòu)建成功的克山病動物模型［7］。

過度營養(yǎng)與感染性疾病的關(guān)系也非常密切，過度營養(yǎng)及營養(yǎng)不良的登革熱患者癥狀均較嚴(yán)重［12］，但營養(yǎng)對宿主登革易感性的影響缺乏相關(guān)研究。另外，在動物實驗中，過量補充ω-3脂肪酸可削弱宿主對胞內(nèi)寄生病原的抵抗力［13］。

2 營養(yǎng)變化與易感性的機制

營養(yǎng)導(dǎo)致宿主疾病易感性的變化很大程度上是通過影響免疫功能來實現(xiàn)的，但是營養(yǎng)成分也可直接干預(yù)病毒的毒力、作用于病毒的進化。

2.1 營養(yǎng)與病原毒力及進化

砷能夠影響病毒的復(fù)制和抑制感染［14］，而硒與病毒的感染關(guān)系也十分密切。在低硒飲食的實驗動物，柯薩奇病毒和流感病毒的毒力得以增強；單純皰疹病毒1型卻在高硒狀態(tài)下毒力更強。不同病毒對硒的不同反應(yīng)證實硒可直接影響病毒的毒力。上述弱毒株在硒缺乏的小鼠轉(zhuǎn)變?yōu)槎玖χ陼r，病毒基因會發(fā)生變異，出現(xiàn)毒力決定基；如果敲除硒谷胱甘肽過氧化物酶基因，實驗動物感染病毒時也有類似的表現(xiàn)。因此營養(yǎng)直接與病毒進化相關(guān)，也是新生病毒出現(xiàn)的原因之一［7，15］。究其原因，可能是因為微量元素是病毒RNA多聚酶發(fā)揮活性的保障，同時RNA多聚酶也是病毒變異的“熱點”，微量元素的變化促進了病毒的變異和進化?？滤_奇病毒及流感病毒的RNA多聚酶活性依賴于硒，而EV71的RNA多聚酶活性依賴于錳［16］，提示可通過干預(yù)錳的含量來提高宿主對EV71的易感性，如同在硒缺乏的動物構(gòu)建克山病動物模型一樣來開發(fā)良好的手足口病模型。上述結(jié)果也顯示了營養(yǎng)干預(yù)有可能取代基因敲除用于開發(fā)病毒感染動物模型。

2.2 營養(yǎng)與粘膜免疫

免疫細胞功能旺盛、代謝活躍，對于營養(yǎng)的變化較為敏感。營養(yǎng)變化對固有性及適應(yīng)性免疫功能均可產(chǎn)生影響，由此可調(diào)節(jié)宿主對非胃腸道及胃腸道途徑傳播病毒的易感性。營養(yǎng)攝入的重要途徑是經(jīng)消化道吸收，消化道也正是粘膜免疫發(fā)揮作用的重要場所，通過影響粘膜免疫，營養(yǎng)因而可更直接地干預(yù)腸道病毒的感染。

粘膜免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)包括屏障結(jié)構(gòu)、分泌型IgA及重要的免疫細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞、CD8ααT細胞等；而屏障結(jié)構(gòu)中除了有腸上皮構(gòu)成的物理屏障、消化液參與構(gòu)成的化學(xué)屏障外，腸道菌群也參與構(gòu)成生物屏障。粘膜免疫與免疫耐受的動態(tài)平衡維持了對食物的口服耐受，確保營養(yǎng)的攝入；在清除病原微生物的同時，使共生或益生微生物能夠長期定居［17］?；钚跃S生素通過其受體調(diào)節(jié)使腸道內(nèi)淋巴組織的T細胞歸巢，這一作用受抑制后，腸粘膜淋巴結(jié) CD8ααT細胞數(shù)目減少，導(dǎo)致IL-10分泌水平降低，從而對共生菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答［18］。維生素A可通過維甲酸受體活化樹突狀細胞從而改善粘膜免疫［19］。而腸道菌群通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路與粘膜免疫相互作用，從而調(diào)節(jié)腸道屏障的完整性［20］。

腸上皮由單層上皮細胞組成的，是腸腔內(nèi)食源性成分、微生物與免疫系統(tǒng)相互作用的界面。細胞間有由緊密連接蛋白與肌動蛋白組成的緊密連接，通過它可調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性。腸道微生物通過影響胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，改變緊密連接蛋白的表達和分布，共生或者益生菌可增加細胞周邊的緊密連接蛋白含量；食物某些成分亦可通過緊密連接蛋白調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性［21］。隨著粘膜免疫與免疫耐受的平衡紊亂，免疫耐受被打破，物理屏障遭到自身抗體及自身反應(yīng)性T淋巴細胞的破壞；對共生菌及益生菌產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，不但直接削弱生物屏障作用，而且也導(dǎo)致了共生菌及益生菌對物理屏障調(diào)節(jié)作用的下降；益生菌參與食物的消化及營養(yǎng)的吸收，其被清除，導(dǎo)致具有腸屏障調(diào)節(jié)作用的營養(yǎng)成分攝入下降，進一步加重了腸道屏障的破壞程度［22，23］。上述過程直接增加了宿主對腸道病毒的易感性。

綜上所述，營養(yǎng)與粘膜免疫的相互作用可影響宿主的病毒易感性，尤其對于腸道病毒更具有直接的影響，因此通過營養(yǎng)干預(yù)構(gòu)建勝任的EV71等腸道病毒感染動物模型就有高度的可行性。另外，腸道菌群是粘膜免疫的重要組成部分，無菌或悉生動物因腸道無菌群或與普通動物不同，因此基于它們的模型并不能充分反映病毒的自然感染途徑和移行。

3 營養(yǎng)方式與動物模型

營養(yǎng)可通過雙向性、劑量依賴效應(yīng)及病原依賴等方式影響疾病易感性，營養(yǎng)不良及過度營養(yǎng)都可能提高宿主的疾病易感性［24］。對于宿主病毒易感性產(chǎn)生影響的營養(yǎng)成分眾多，并且微量元素及維生素等的變化精細，因此需要通過新的營養(yǎng)方式保證營養(yǎng)成分較精確地攝入。另外，感染導(dǎo)致的免疫功能變化反饋調(diào)節(jié)瘦素，通過影響食欲使攝食量發(fā)生變化［25］，從而營養(yǎng)攝入發(fā)生變化，免疫功能及易感性隨之又發(fā)生變化，建模動物的營養(yǎng)、免疫及易感性實質(zhì)處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。因此營養(yǎng)是動物模型有效性發(fā)揮的前提，實驗動物營養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)化可縮小為消除誤差而設(shè)置的樣本規(guī)模，從而降低實驗動物的消耗。值得注意的是，營養(yǎng)、免疫與感染的相互作用還可導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度的改變［12］，因此在藥物和疫苗評價時，如果無法保障實驗動物的營養(yǎng)背景均質(zhì)，則可能導(dǎo)致失真結(jié)果的出現(xiàn)。因此，在動物模型開發(fā)和應(yīng)用的全程，均應(yīng)保證實驗動物的營養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)。

實驗動物的營養(yǎng)方式主要有自由取食和強制營養(yǎng)。穩(wěn)定營養(yǎng)的前提是等量攝入成分一致的飼料，自由取食很難保證。強制營養(yǎng)可保證定量攝食，但與自主咀嚼相比，它不僅抑制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可降低實驗動物的生存率［26］。應(yīng)用自愿營養(yǎng)模型或者配方飼料手工喂養(yǎng)是克服上述缺點的有效手段［27-29］。定量攝食是營養(yǎng)均質(zhì)化的開端，開發(fā)二代營養(yǎng)模型可提供進一步的保障。親代包括母系及父系都對后代的營養(yǎng)狀態(tài)產(chǎn)生重要影響，并且包括營養(yǎng)在內(nèi)的環(huán)境因素造成的表觀遺傳變化也能通過哺乳動物的生殖而遺傳［30，31］，因此在親代應(yīng)用自愿營養(yǎng)法就有可能獲得營養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)、穩(wěn)定的子代。在此二代營養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上進行病毒感染模型的構(gòu)建，將有助于當(dāng)前難題的克服。

4 結(jié)語

在新現(xiàn)病毒性疾病的研究中，缺乏勝任動物模型是重要的限制“瓶頸”。除了應(yīng)用不依賴于動物實驗的研究方法外［32］，通過營養(yǎng)干預(yù)宿主的病毒易感性以建立符合“3R”原則并可充分再現(xiàn)人類疾病特征的動物模型具有可實踐性。

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