宗園媛，朱 華，王海林，徐艷峰，馬春梅，代小偉，黃 瀾，李曉穎，董 偉，張連峰，秦 川

（衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 10021）

阿爾茨海默?。ˋ lzheimer's disease，AD）是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要三大病理變化是神經(jīng)細胞外老年斑沉積、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)元缺失等［1］。microRNA的出現(xiàn)為AD的發(fā)病機制研究提供了新的思路。microRNA （微小RNA，簡稱m iRNA）是生物體內(nèi)源長度約為20～23個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導致mRNA的降解或翻譯抑制［2-4］。許多miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達或大量表達，其參與了神經(jīng)分化，突觸可塑性及記憶形成［5］。目前國際上已有多篇文獻證實miRNA與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的多種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關［6-8］。本實驗為了探討miRNA在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，我們采用了miRNA芯片檢測3月齡、6月齡APP/PS雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型大腦中miRNA表達情況，并通過實時定量 PCR證實m iR-29c在3、6、9月齡小鼠中表達明顯升高，通過體外細胞水平研究證實 miR-29c可以減少 APP蛋白的表達，豐富了m iRNA與阿爾茨海默病之間的相關性研究，為阿爾茨海默病發(fā)病與治療研究提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

APPswe/PSΔE9雙轉基因 C57BL/6J小鼠由本所遺傳中心提供，啟動子為mPrP promoter。APPswe是“瑞典家族”突變，突變發(fā)生在 APP編碼序列 N端的670，671位點的賴氨酸與甲硫氨酸分別被天冬酰氨與亮氨酸取代。PS1ΔE9是在家族性AD中發(fā)現(xiàn)的PS1基因第9外顯子缺失。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（GC-07-2053）。

1.2 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠大腦 microRNA芯片檢測

我們之前的研究中［9］已經(jīng)闡述了利用3、6月齡APPswe/PSΔE9轉基因小鼠送LC Sciences公司進行microRNA芯片的檢測，miRNA探針序列信息來自于Sanger miRbase Release 9.2版本數(shù)據(jù)庫，每種探針至少重復3次。雜交使用Cy3、Cy5熒光標記。芯片及探針合成經(jīng)過質量控制。3月芯片探針總數(shù)為737，6月芯片探針總數(shù)為1094。數(shù)據(jù)處理和分析首先是扣除背景，計算重復點平均值和標準偏差，然后通過 LOWESS（locally-weighted regression）過濾進行標準化。對于雙色標記實驗，將計算兩種檢測信號的比值（log2）和t-test的P值，以P＜0.01定義顯著差異性表達。選用組織內(nèi)源的 5S rRNA作為m iRNA芯片的內(nèi)源陽性對照。陰性對照包括針對LC Sciences人工合成序列的單堿基錯配探針外，還設計了兩組探針：一組是空白對照，另一組是與實驗樣品無同源性的核酸序列探針。

1.3 realtimePCR檢測驗證 APPSWE/PS1ΔE9雙轉基因AD小鼠模型大腦皮層及海馬中microRNA的表達水平變化

選用3、6、9月齡APPswe/PSΔE9轉基因小鼠各6只，利用 Ambion RNA提取試劑盒提取小鼠組織富含miRNA的總RNA，利用德國QIAGEN公司real time PCR試劑盒檢測m iR-29c的表達情況。引物序列：正義：TAGCACCATTTGAAATCGGTT，反義：GAATCGAGCATCAGTTACG。PCR產(chǎn)物80 bp。以U6snRNA為內(nèi)參。用delta-delta C（t）的方法和 ttest對數(shù)據(jù)進行分析和統(tǒng)計學處理，以P＜0.05定義顯著差異性表達。

1.4 miR-29c表達載體構建及高表達 miR-29c細胞系的建立

在sanger miR數(shù)據(jù)庫 http：//m icrorna.sanger.ac.uk/中檢索 miR-29c堿基序列，合成 64 bp的oligo互補雙鏈。利用 invitrogen公司的 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR線形載體構建 m iR-29c表達載體，篩選陽性克隆送測序。選用正確表達 miR-29c的克隆提取質粒。利用脂質體法轉染SH-SY5Y細胞，利用 Blasticidine進行陽性克隆的篩選，檢測m iR-29c的表達情況，構建高表達 m iR-29c的穩(wěn)定轉染細胞系。

1.5 miR-29c靶基因的預測

本實驗綜合分析了TargetScan、miRBase、miRanda、PicTar四個數(shù)據(jù)庫。只有miRBase預測了m iR-29c可與APP的結合，結合位點位于APPmRNA3’UTR 1068～1089 bp。

1.6 hAPPcDNA質粒與miR-29C質粒共同瞬時轉染

NCBI上公布的人APP基因的轉錄產(chǎn)物共有3種，命名為APPmRNA1-3，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)3種轉錄體mRNA的3’UTR序列完全一致。APPcDNA載體（購自美國Qrigene公司，包含全長3’UTR，總長1.1 kb，NM_201413.1）與 miR-29c表達載體共轉染到24孔板中的 HEK-293T細胞中，重復2個孔。48 h后，提取細胞總蛋白，Western blot檢測APP蛋白的表達情況，以同時轉染miR陰性對照質粒及APPcDNA載體為對照。

1.7 Westernblot

分別自鼠腦及細胞中提取總蛋白。脫頸椎法犧牲小鼠，取小鼠海馬及其上皮質腦組織（約 80 mg）取出迅速置研磨器中，放入勻漿器內(nèi)，加入1 mL RIPA裂解液及10μL PMSF，充分研磨。細胞總蛋白提取時每6孔板加入300 uL RIPA裂解液，3 uL PMSF用槍頭吹打后，吸入1.5 m LEP管中。分別冰上靜置30 m in，使蛋白徹底的裂解，4℃，14000 g離心30 m in。利用 BCATMProtein Assay Kit對提取的蛋白進行濃度的測定?？偟鞍咨蠘恿?0 ug，10％ SDS-PAGE上分離，300 mA電轉移1.5 h到NC膜上，室溫下5％脫脂奶粉/TBS封閉1 h。APP單克隆抗體（6E10，Sigma）1∶200稀釋，4℃過夜孵育。第二天TBST洗膜3次，每次10 min。1∶25，TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗及辣根過氧化物酶標記的β-actin（用于控制蛋白上樣量，作為內(nèi)參照）。室溫下振蕩孵育1 h。TBS-T漂洗3次，每次10 m in。利用化學發(fā)光劑（Santa Cruz），暗室使膠片曝光。

1.8 雙熒光素酶報告檢測

PCR擴增APP的全長3’UTR（總長約1.1 kb，包含與m iR-29c的預測結合位點并帶XhoI和NotI兩個酶切位點），將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，命名為 T-APP3’UTR。根據(jù) m iRBase預測，miR-29c與APP的結合位點位于APPmRNA 3’UTR 1068～1089 bp，據(jù)此我們構建了利用點突變方法構建APP3’UTR突變載體，命名為T-APP3’UTRmut。psiCHECKTM-2載體（Promega）含有兩種熒光素酶：螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。將所構建的TAPP3’UTR，T-APP3’UTRmut載體進行XhoI和NotI雙酶切，將野生型及含有突變位點的APP3’UTR克隆psiCHECKTM-2載體的海腎熒光素酶開放讀碼框架的下游，構建含APP3’UTR及突變的APP3’UTR的熒光素酶報告載體，分別命名為 pAPP3’UTR，pAPP3’UTRmut。將所構建的熒光素酶報告載體與m iR-29c表達載體或者陰性對照載體共轉染 HEK-293T細胞，轉染后48 h，利用雙熒光素酶報告檢測試劑（Promega）及熒光素酶活性檢測儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，并將海腎熒光素酶的活性用螢火蟲熒光素酶的活性進行標準化，比較熒光強度的變化。

2 結果

2.1 microRNA芯片及realtimePCR驗證結果

根據(jù)miRNA芯片結果篩選出一種在3、6月齡APPSWE/PS1ΔE9雙轉基因小鼠大腦及海馬中表達均有差異的 miRNA，即 miR-29c。利用 real time PCR檢測其在3、6、9月齡APPSWE/PS1ΔE9大腦組織中表達增高（圖1）。

2.2 Westernblot檢測在SH-SY5Y細胞系中APP表達情況

我們成功構建了高表達 m iR-29c的穩(wěn)定轉染SH-SY5Y細胞系。利用 real time PCR檢測穩(wěn)轉m iR-29c細胞系中m iR-29c表達增加1.8倍。

Western blot結果顯示高表達 miR-29c的穩(wěn)轉SH-SY5YX細胞系，APP蛋白表達較轉染陰性對照載體的穩(wěn)轉SH-SY5YX細胞系減少22％（圖2）。

2.3 Westernblot檢測在 HEK-293T細胞系中APP表達情況

圖1 3、6、9月齡APPSWE/PS1ΔE9大腦組織中miR-29c表達情況的 real time PCR結果Fig.1 Relative quantity ofmiR-29c in 3，6，9-month-old APPSWE/PS1ΔE9 mice by real time PCR result注：“*”P＜0.05Note：“*”P＜0.05

圖2 高表達m iR-29c的SH-SY5Y細胞系中APP蛋白表達水平分析Fig.2 APP protein expression in overexpression ofmiR-29c SH-SY5Y cell line

APPcDNA載體與miR-29c表達載體共轉染到24孔板中的HEK-293T細胞中，48 h后發(fā)現(xiàn)實驗孔與對照孔轉染效率均約為70～80％。提取細胞總蛋白，總蛋白上樣量20 ug，以β-actin為上樣量內(nèi)參照。Western blot結果顯示m iR-29c組細胞內(nèi) APP蛋白表達明顯減少，平均減少50％。試驗重復2次，結果一致。

圖3 miR-29c與APPcDNA共轉染HEK-293T細胞實驗結果Fig.3 APP protein expression in m iR-29c expression vector and APP cDNA vector transient transfection HEK-293T cell line

2.4 雙熒光素酶報告檢測實驗結果

熒光素酶報告載體與miR-29c表達載體或陰性對照載體共轉染至HEK-293T細胞中，轉染后48 h，收集細胞。所有的實驗均重復3次。熒光素酶活性檢測儀分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，并且用螢火蟲熒光素酶的活性對海腎熒光素酶的活性進行標準化。與陰性對照相比，pAPP 3’UTR，pAPP 3’UTR mut與miR-29c共轉染，標準化后海腎熒光素酶的活性均沒有明顯變化。

3 討論

APP是淀粉樣前體蛋白，廣泛存在于全身組織細胞中，在腦中表達較高。APP屬于I型跨膜蛋白家族成員。APP屬于進化過程中保守的蛋白家族，主要有APP695，APP751，APP770三種形式存在［10］。目前在家族性AD病人中已鑒別出多個APP基因的突變位點，這些突變使得APP代謝途徑發(fā)生異常，雖然只有近1％的EOFAD與APP突變有關。但APP蛋白代謝產(chǎn)物Aβ是阿爾茨海默病中最重要病理學特征-老年斑的重要組成物質，將人突變 APP基因轉入小鼠后，出現(xiàn)與人類阿爾茨海默病人相似的征狀和體征，如老年斑、學習記憶能力異常下降，說明突變的APP基因使小鼠腦中的APP蛋白表達異常增高，可導致APP蛋白代謝產(chǎn)物Aβ大量的積累，以上原因使APP基因在阿爾茨海默病中占有非常重要的地位和意義［11］。最初發(fā)現(xiàn) APP是在 AD中，目前APP的生理功能還未完全明了，認為APP與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化，神經(jīng)突觸的可塑性有關。研究表明 APP經(jīng) γ-分泌酶復合體水解產(chǎn)生的AICDs，參與細胞內(nèi)基因轉錄，細胞動力學及細胞凋亡［12］。

已有研究發(fā)現(xiàn)多種m iRNAs可在阿爾茨海默病中對APP起調(diào)控作用。例如，2009年 Hébert等人發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病人大腦中 miR-106b降低促進APP表達增多，并證實miR-106b可在細胞內(nèi)直接結合APP mRNA 3’UTR，但沒有確定結合位點［13］。2010年 Wei Liu等人在早老小鼠 SAMP8中發(fā)現(xiàn)m iR-16可下調(diào)APP表達［14］。2011年 Justin等人證實在細胞水平 m iR-101可內(nèi)調(diào)節(jié) APP的表達［15］。對于m iR-29c卻沒有人設想過能夠調(diào)控APP蛋白的表達。我們使用了 miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)m iRBase、m iRanda、PicTar和 TargetScan四種數(shù)據(jù)庫綜合，但除m iRBase外，所有常用的m iRNA預測數(shù)據(jù)庫沒有預測出m iR-29c可以負向調(diào)控APP。我們采用了miRNA芯片檢測3、6月齡APP/PS雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型大腦中miRNA表達情況，并通過實時定量PCR證實miR-29c在3月、6月、9月齡小鼠中表達明顯升高。結合m iRBase的預測，我們在穩(wěn)定表達m iR-29c的SH-SY5Y細胞系中通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)APP蛋白的表達減少。共轉染m iR-29c表達載體及 APP表達載體到 HEK-293T細胞，Western blot檢測APP蛋白明顯減少，在HEK-293T細胞中通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測，沒有發(fā)現(xiàn)轉染miR-29c細胞的熒光素酶表達明顯減少。通過對實驗結果初步分析我們認為可能m iR-29c對 APP mRNA的調(diào)控位點可能不在 APP3’UTR。根據(jù)文獻報道，m iRNA對靶基因的調(diào)控位點也可能位于開放閱讀框（open reading frames，ORF）及植物5’UTR內(nèi)［16-17］。m iR-29c對 APPmRNA具體的調(diào)控位點仍需要進一步實驗探索。

在 APPSWE/PS1ΔE9雙轉基因小鼠體內(nèi)miR29c表達增高，我們分析認為可能是一種自身保護機制。APPSWE/PS1ΔE9雙轉基因小鼠是一種能夠產(chǎn)生大量 APP蛋白及老年斑的轉基因小鼠［18］，而m iR-29c的表達升高可能是為了對抗 APP蛋白升高，是小鼠體內(nèi)的一種保護性反饋抑制，以減少體內(nèi)APP代謝途徑中Aβ蛋白最終生成。這可能與之前發(fā)現(xiàn)的阿爾茨海默病人中 miR-106b等微小RNA的作用等不同，阿爾茨海默病人中 m iR-106b減少促進了阿爾茨海默病人大腦中產(chǎn)生APP。

本課題通過在體外水平證實了miR-29c對靶基因APP表達的存在負向調(diào)控作用，為阿爾茨海默病的治療提供了新的思路。

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