程海梅，徐 春，楊雪梅，劉曉軍

（1.武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100039；2.武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039）

催乳素瘤（PRL瘤）是最常見的功能性垂體腺瘤，可引起閉經(jīng)、泌乳、不孕（育）、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌紊亂，垂體增大可壓迫鄰近組織出現(xiàn)視力減退、視野缺損、顱內(nèi)高壓等表現(xiàn)，因其生長隱匿常不能早期發(fā)現(xiàn)，嚴重危害人類健康。PRL瘤主要是單克隆細胞起源，對于其確切的發(fā)病機制，目前還不是很統(tǒng)一。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）是第一個在大多數(shù)垂體腺瘤中表達的腫瘤轉(zhuǎn)化基因，PTTG過度表達促進垂體腺瘤形成的機制目前仍無圓滿的解釋。細胞周期調(diào)節(jié)失控導致細胞增殖是腫瘤發(fā)生的重要原因，腺病毒E2啟動子結(jié)合因子1（E2F-1）是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵因子之一，其通過調(diào)控一系列靶基因的表達來促進細胞周期的進程。有研究發(fā)現(xiàn)，PTTG啟動子上存在 E2F-1的特異結(jié)合序列，PTTG的高表達是否與 E2F-1有關(guān)，E2F-1在PRL瘤形成過程中究竟起到什么作用，本研究采用免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)錄因子E2F-1蛋白質(zhì)和PTTG蛋白質(zhì)在雌激素誘發(fā)的大鼠PRL瘤中的表達情況，探討兩者在PRL瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及兩者之間是否有關(guān)。定后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚約3 um，蘇木素-伊紅染色，封片進行顯微鏡觀察。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

成年雄性W istar大鼠（體重120～150 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，編號：SCXK（軍） 2007-004）；17β-雌二醇（由 Sigma公司提供）；血清催乳素檢測試劑盒（購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；兔抗鼠PTTG多克隆抗體（工作濃度1∶200～500），兔抗鼠E2F-1多克隆抗體（工作濃度1∶200～500），濃縮型DAB顯色液以及 SP染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠 PRL瘤模型的制備：40只成年大鼠（120～150 g）隨機分為2組：正常對照組（C組，n= 20只）皮下植入空白硅膠管；PRL瘤組（P組，n=20只）皮下植入含有17β-雌二醇（約20 mg）的硅膠管；用藥10周后，用水合氯醛麻醉大鼠，心臟穿刺取血，4％多聚甲醛心臟灌流體內(nèi)固定，取出垂體，稱重后放于4％多聚甲醛內(nèi)固定。

1.2.2 垂體組織的病理學觀察：標本經(jīng)多聚甲醛固

用藥10周后，實驗組大鼠與對照組比較，平均體重明顯降低（P＜0.01）；垂體重量明顯增加（P＜0.01）；血清PRL水平明顯升高（P＜0.01）（表1）。

1.2.3 ELISA法測定血清 PRL水平：心臟穿刺取血1 m L，室溫自然凝固，離心（3000 rpm，15 min）后取血清，放入 -70℃冰箱保存。待標本收集完用ELASA測定大鼠血清催乳素水平。

1.2.4 免疫組化SP法檢測PTTG蛋白質(zhì)、E2F-1蛋白質(zhì)的表達：垂體經(jīng)4％多聚甲醛固定、石蠟包埋、3μm連續(xù)切片。免疫組化染色操作步驟按說明書進行。采用已知陽性片為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

PTTG蛋白質(zhì)和E2F-1蛋白質(zhì)陽性表達均為胞漿和胞核內(nèi)棕黃色顆粒。本實驗結(jié)果判定標準參照Fromowitz［1］綜合計分法：隨機選擇5個高倍鏡視野（200×），按陽性細胞所占比例及細胞染色強度進行分級：陽性細胞數(shù) ＜5％為0分，6～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分；染色強度評分：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項積分相加：0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，大鼠體重、垂體重量、PRL瘤以X±S表示，兩組間差異用t檢驗，免疫組化結(jié)果分析采用卡方檢驗，相關(guān)性分析應用Spearman相關(guān)性檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重、垂體重量、血清 PRL水平的比較

2.2 兩組大鼠垂體組織病理學的比較

HE染色下，對照組垂體細胞排列規(guī)則，呈圓形，胞漿少，胞核大小一致，以嗜酸性粒細胞為主（封2圖1）。實驗組細胞排列紊亂，細胞數(shù)目明顯增加，細胞呈圓形或多角形，胞體增大，胞漿帶增寬，細胞分化差，核大小不一致，可見大核細胞，細胞增生明顯，以嗜酸性粒細胞為主（封2圖2）。

表1 兩組大鼠體重、垂體重量、血清PRL水平比較Tab.1 Comparation of body weight，pituitary weight，serum PRL levels

表2 兩組大鼠垂體中PTTG蛋白質(zhì)、E2F-1蛋白質(zhì)表達情況Tab.2 Comparation of PTTG、E2F-1 protein expression between the two groups

2.3 PTTG蛋白質(zhì)在兩組大鼠垂體的表達

PTTG蛋白質(zhì)在實驗組呈高表達70％（14/20），陽性顆粒主要出現(xiàn)在胞漿，部分位于細胞核，呈棕黃色或黃褐色顆粒（封2圖4），顯著高于對照組10％（2/20），對照組著色細胞數(shù)目少，細胞染色淺，與背景顏色難以區(qū)分（封2圖3），兩組差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.4 E2F-1蛋白質(zhì)在兩組大鼠垂體的表達

E2F-1蛋白質(zhì)在實驗組呈高表達 80％（16/ 20），陽性顆粒胞漿和胞核中彌漫分布，染色較深（封2圖6），顯著高于對照組20％（4/20），且對照組陽性顆粒主要位于胞漿，染色較淺（封2圖5），兩組差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.5 PTTG蛋白質(zhì)和E2F-1蛋白質(zhì)在大鼠PRL瘤中表達的相關(guān)性

PRL瘤組14例 PTTG蛋白質(zhì)陽性的標本中E2F-1蛋白陽性者13例，陰性1例；6例 PTTG蛋白陰性的標本中E2F-1蛋白質(zhì)陽性者3例，陰性3例，兩者表達一致率為70％，統(tǒng)計學分析PTTG表達與E2F-1表達呈顯著正相關(guān)（γ=0.764，P＜0.051）。

3 討論

雌激素是垂體催乳素（PRL）細胞增生和 PRL基因表達的強有力的刺激因子，雌激素長期作用引起垂體 PRL細胞增生、PRL分泌增加，最終形成PRL瘤。由于垂體的特殊性，正常垂體難以獲得，建立穩(wěn)定、可靠的大鼠垂體腺瘤模型對研究腺瘤的發(fā)病機制和尋找有效的治療措施具有重要意義。有研究顯示，長期給予大鼠雌激素，可誘發(fā)大鼠PRL瘤。大鼠垂體腺瘤動物模型的成功與否可以從三個方面進行判斷：（1）一般認為大鼠垂體重量超過50 mg即可判斷為腺瘤［5］，也有觀點認為大于30 mg即可判定建模成功［6］；（2）血漿PRL濃度顯著增高； （3）組織病理學檢查。本實驗選用 W istar大鼠，用皮下植入含有雌激素的硅膠管，結(jié)合上述指標分析，10周后垂體瘤模型成功率達100％。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）是Pei［4］等用mRNA差異顯示技術(shù)從大鼠垂體瘤細胞中分離出的新型原癌基因，體外研究它能誘導NIH3T3成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)能誘發(fā)裸鼠實體腫瘤的形成，是一種強有力的腫瘤轉(zhuǎn)化基因。PTTG通過促進細胞轉(zhuǎn)化、誘導血管形成、抑制姊妹染色單體分離、反式激活c-myc等癌基因的途徑參與腫瘤的形成。腫瘤細胞中PTTG cDNA的序列分析未發(fā)現(xiàn)突變，PTTGmRNA表達水平卻明顯升高，說明其致癌作用主要依賴于其表達水平的高低［5］。Donangelo［6］等發(fā)現(xiàn)，PTTG失活的小鼠表現(xiàn)出垂體增生不良，而PTTG過表達導致垂體局灶性增生說明PTTG含量與垂體增生和腫瘤的形成直接相關(guān)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠PRL瘤中PTTG蛋白質(zhì)表達明顯增高，正常垂體組織中無明顯表達，說明PTTG在PRL瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

E2F-1作為轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，對于調(diào)節(jié)細胞由G1期進入S期起著至關(guān)重要的作用。在G0和G1早期，E2F-1與低磷酸化的 pRb結(jié)合，E2F-1轉(zhuǎn)錄活性受抑制；G1中后期，pRb被cyclin D/cdk4/ 6和 cyclin E/cdk2磷酸化后，E2F-1與 Rb分離，E2F-1被游離后與其靶基因結(jié)合，激活它們的轉(zhuǎn)錄［7］。

很多參與DNA復制和細胞周期調(diào)控的基因啟動子區(qū)存在E2F-1 DNA結(jié)合位點，E2F-1與其結(jié)合后，促使細胞由G1期進入S期，繼而推動細胞周期進程，導致細胞增殖和腫瘤的形成。迄今為止發(fā)現(xiàn)，E2F-1可以參與 1000多種基因的調(diào)控［8］。Zhou［9］等發(fā)現(xiàn)，PTTG啟動子上也存在 E2F-1的特異結(jié)合序列，E2F-1與 PTTG啟動子結(jié)合后，激活PTTG的轉(zhuǎn)錄。研究還發(fā)現(xiàn)，E2F-1和 PTTG在 Rb +/-鼠垂體組織和人垂體腫瘤中成一致高表達。體外 H1299細胞轉(zhuǎn)染表達 E2F-1的質(zhì)粒后，PTTGmRNA表達水平明顯升高；將Rb siRNA轉(zhuǎn)染H1299細胞后，Rb被抑制，E2F-1表達水平升高，同時PTTG表達量也明顯上調(diào)，這些提示PTTG的表達可能受E2F-1的調(diào)控。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，PTTG蛋白質(zhì)和E2F-1蛋白質(zhì)在雌激素誘導的大鼠PRL瘤中呈一致高表達，進一步證實了兩者之間的關(guān)系。

Yamasaki［10］等研究則發(fā)現(xiàn)，E2F-1缺失的 Rb1 （+/-）小鼠垂體腫瘤的發(fā)生率減少，提示 E2F-1可能在垂體腺瘤的發(fā)生中起到一定作用。本實驗發(fā)現(xiàn)：E2F-1蛋白在大鼠PRL瘤中的表達明顯高于正常垂體組織，并且E2F-1蛋白質(zhì)與PTTG蛋白質(zhì)表達呈明顯正相關(guān)，說明E2F-1在PRL瘤的發(fā)生發(fā)展中起著促進作用，作者推測可能是通過調(diào)控PTTG的表達來實現(xiàn)。

基于E2F-1在腫瘤中的異常表達及其對細胞周期和細胞凋亡的調(diào)控，出現(xiàn)了很多針對E2F-1作為靶點設(shè)計的腫瘤基因治療試驗，并取得了初步成效［11-13］。明確了E2F-1在垂體腫瘤形成過程中的作用，有利于從分子水平開展對垂體腫瘤基因治療的研究。

綜上，用皮下植入雌激素的方法能成功誘導Wistar大鼠PRL瘤的發(fā)生，PTTG蛋白質(zhì)與E2F-1蛋白質(zhì)在雌激素誘發(fā)的大鼠PRL瘤中呈一致高表達，兩者共同參與了大鼠PRL瘤的發(fā)生發(fā)展，這對以后垂體腫瘤的治療提供了更多的契機。

［1］Fromowitz FB，et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer［J］.Hum Pathol，1987，18（12）：1268-1275.

［2］Clifton KH，Meyer RK，Mechanism of anterior pituitary tumor induction by estrogen［J］.Anat Rec.1956；125（1）：65-68.

［3］薛毅瓏，段國升，張燦元。雌酮誘發(fā)大白鼠垂體腺瘤的動物模型［J］。中華實驗外科雜志，1992，9：1-36.

［4］Pei L，Melmed S.Isolation and characterization of a pituitary tumor transforming gene（PTTG）［J］.Mol Endocrinol，1997； 11（4）：433-441.

［5］Kanakis D，Kirches E，Mawrin C，et al.Promoter mutations are no major cause of PTTG overexpression in pituitary adenomas［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2003，58（2）：151-155.

［6］Ines Donangelo.Pituitary tumor transforming gene overexpression facilitates pituitary tumor development［J］.Endocrinology，2006，147（10）：4781-4791.

［7］Harbour JW，Dean D C.The Rb/E2F pathway：expanding roles and emerging paradigms［J］.Genes Dev，2000，14（19）：2393 -2409.

［8］Fikret Sahin，Todd L.Sladek.E2F-1 has dual roles depending on the cell cycle［J］.Biol.Sci.2010；6（2）：116-128.

［9］Cuiqi Zhou，Kolja W，Serguei B，et al.E2F-1 induces pituitary tumor transforming gene（PTTG1）expression in human pituitary tumors［J］.Molecular Endocrinology，2009，23（12）：2000 -2012.

［10］Yamasaki L，Bronson R，Williams，et al.Loss of E2F-1 reduced tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1（+/-）mice［J］.Nat.Genet，1998，18：360-364.

［11］Gomez-Gutierrez JG， Garcia-GarciaA， HaoH，etal.Adenovirus-mediated expression of truncated E2F-1 suppresses tumor growth in vitro and in vivo［J］.Cancer，2010；116（18）：4420-32.

［12］Yan LH，Li L，Xie YB，etal.Effects of E2F-1 overexpression on apoptosis of gastric cancer cells and expressions of apoptosisrelated genes［J］.Ai Zheng.2009；28（11）：1176-80.

［13］Xie Y，Yin Y，Li L，et al.Short interfering RNA directed against the E2F-1 gene suppressing gastric cancer progression in vitro.Oncol［J］.2009；21（5）：1345-53.