吳學玲，代沁蕓，梁任星，王洋洋

（中南大學 資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083）

利用高效降解菌株強化修復土壤中DBP及其細菌群落動態(tài)解析

吳學玲，代沁蕓，梁任星，王洋洋

（中南大學 資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083）

在實驗室條件下，研究土壤中分別加入鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和同時加入DBP及高效降解菌JDC13后，對土壤中DBP降解的影響以及土壤中細菌總數(shù)和細菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。通過高效液相色譜（HPLC）檢測土壤中DBP的殘留含量。通過變性梯度凝膠電泳（DGGE）檢測土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。研究結(jié)果表明：只加入DBP的樣品A中，DBP在14 d時被完全降解；加入DBP和JDC13的樣品B中，DBP在9 d時被完全降解，說明JDC13有效加快了土壤中DBP的降解速度；土壤中細菌總數(shù)測定結(jié)果顯示DBP會抑制土著細菌的生長，但加入JDC13后可以減少DBP的這種不利影響；只加入DBP和同時加入DBP與JDC13對土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)的影響十分明顯；JDC13、放線菌和β變形菌在土壤DBP降解過程中成為優(yōu)勢種群；大部分優(yōu)勢菌與PAEs（鄰苯二甲酸酯）降解菌具有同源性。

DBP；生物降解；生物強化；PCR?DGGE；細菌群落

鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物即鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）類化合物的一種[1]。PAEs具有環(huán)境激素作用，可在極低的濃度下干擾人類和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，目前已被多個國家列為優(yōu)先控制的污染物[2]。近年來，由于DBP的廣泛應用，土壤、河流、湖泊、海洋底質(zhì)、飲用水、垃圾場甚至食品中都檢測到DBP，對人類的身體健康造成了嚴重的威脅[3]。DBP在環(huán)境中的水解、光解速度非常緩慢，屬于難降解物質(zhì)。然而，利用一些微生物和淡水無脊椎動物可代謝DBP，半衰期僅為1～3 d，因此，微生物降解被認為是自然環(huán)境中DBP完全礦化的主要過程[4]。大量降解菌從各類環(huán)境中分離得到，主要包括變形菌門、放線菌門（高G+C革蘭氏陽性菌）、厚壁菌門（低G+C革蘭氏陽性菌）和綠菌門4個大類[5]。生物強化（Bioaugmentation）是接種具有特定降解能力的微生物來增強環(huán)境中的生物活性，以達到修復污染環(huán)境的目的[6]。研究結(jié)果表明：生物強化可以通過外源菌的引入改變原有的微生物群落結(jié)構(gòu)，并且有可能改變原有的生化過程。因此，外源菌在自然環(huán)境中能否發(fā)揮降解作用，是生物能否強化的關(guān)鍵[7?8]。外源投入的微生物本身在環(huán)境中的行為和對環(huán)境的影響也成為研究的重要方向[9]。在此，本文作者以加入DBP的土壤為研究對象，考察利用DBP高效降解菌JDC13進行生物強化修復的效果，主要包括DBP在土壤中的降解情況和土壤中細菌總數(shù)的動態(tài)變化，并利用現(xiàn)代分子生物學手段即PCR?DGGE對土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)的變化進行監(jiān)測，以便為生物強化技術(shù)的實際應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

供試土壤采于長沙市岳麓山表層0～15 cm土壤。其基本性質(zhì)如下：pH為6.2；黏粒（粒徑≤2 μm） 含量為28.50%；有機質(zhì)含量為86.5 g/kg，全氮含量為3.89 g/kg。土壤樣品用無菌袋封存于溫度為4 ℃的冰箱中。

1.2 降解菌的準備

從污染的河底污泥里分離得到的一株DBP高效降解菌JDC13，經(jīng)16Sr RNA鑒定，JDC13 為Gordoniasp.。將篩選的JDC13于DBP培養(yǎng)基（K2HPO45.8 g/L, KH2PO44.5 g/L, （NH4）2SO42.0 g/L, MgCl20.16 g/L, CaCl20.02 g/L, Na2MoO4·2H2O 2.4 mg/L, FeCl31.8 g/L, MnCl2·2H2O 1.5 mg/L, DBP 0.4 g/L, pH=7.0）中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心5 min，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌3次，再用無菌水懸浮菌體，最終使菌液濃度為1×109個/mL。

1.3 土壤中DBP的降解

取部分土壤樣品，過150 μm篩濾除石頭、植物等雜質(zhì)，風干過夜。在土壤樣品中加入DBP甲醇溶液（1 mL甲醇中含100 mg DBP）。于121 ℃滅菌60 min以上，置于無菌通風櫥內(nèi)風干甲醇。將原始土壤和上述處理過的土壤按質(zhì)量比19：1的比例混合，充分混勻，最終土壤中DBP的含量為0.8 mg/g。

實驗分為2組：第1組（樣品A）取40 g實驗土壤于500 mL三角瓶中；第2組（樣品B）取40 g實驗土壤于500 mL三角瓶中，加入降解菌JDC13的懸浮液至最終密度為1×107個/g。將三角瓶置于30 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，并定期加入適量無菌水以保持濕度。在第0，2，4，6，9，14和20天時取樣分析。

土壤中殘留DBP的含量使用高效液相色譜（HPLC）進行檢測。取1 g土樣，加入10 mL乙酸乙酯，充分振蕩，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心1 min，吸取上清液至燒杯中，重復3次。風干燒杯中的乙酸乙酯。將甲醇定容至5 mL用HPLC檢測。HPLC使用Hyersil DBS C18柱（伊利特，大連）。流動相為甲醇和水（體積比為9?1），溫度為35 ℃，流速為1 mL/min，吸收波長為228 nm。

1.4 土壤中細菌總數(shù)的測定

土壤中細菌總數(shù)采用活菌平板計數(shù)法測定[10]。稱取1 g土壤樣品置于滅菌三角瓶中，加入100 mL質(zhì)量分數(shù)為0.85%的無菌NaCl水溶液，于轉(zhuǎn)速250 r/min下振蕩30 min。取1 mL上清液稀釋10倍涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，于30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，再進行平板計數(shù)。

1.5 土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析

土壤基因組DNA的提取參考Zhou等[11]的提取方法。提取的基因組經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收純化后，置于?20 ℃保藏備用。

細菌PCR擴增引物選用16Sr RNA基因V3區(qū)域通用引物對GC341F（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′）和534R（5′-A TTACCGCGGCTGCTGG-3′）[12]。擴增體系為：10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，25 mmol/L MgCl25 μL, 5 U/μL Taq酶1 μL，10 pmol/μL引物各1 μL，DNA模板3 μL，加H2O補齊50 μL。擴增程序采用降落式PCR：于95 ℃延伸5 min，于94 ℃解鏈1 min，于65 ℃退火1 min，循環(huán)20次，每次循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃；于72 ℃延伸1 min；于94 ℃解鏈1 min，于55 ℃退火1 min，循環(huán)15次；于72 ℃延伸1 min；于72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

DGGE使用美國C.B.S公司的DGGE?2401電泳槽。電泳使用質(zhì)量分數(shù)為7.5%的聚丙烯酰胺凝膠（m（丙烯酰胺）/m（甲叉雙丙烯酰胺）=37.5），變性膠濃度梯度為45%～65%（100%的變性劑中含7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺）。使用TAE為電泳緩沖液，上樣15 μL PCR產(chǎn)物。電泳條件為：在60 ℃恒溫下，于200 V時電泳6 h。然后，用溴乙錠染色30 min。在紫外凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳結(jié)果，對20個不同位置的較亮條帶進行切膠。DNA溶解，再使用不帶GC鏈的F341和R534引物對進行PCR擴增。產(chǎn)物送上海桑尼生物公司測序。

DGGE圖譜采用Bio-rad公司的Quantity one軟件分析，將圖像信息轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息后用Microsoft公司的SPSS軟件進行聚類分析。將測序所得序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行序列比較，下載相似序列，用clustalx1.8軟件進行序列比對，并采用鄰接法（Neighbor joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

2 分析

2.1 土壤中DBP的降解和動力學分析

土壤樣品中DBP的降解結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出：樣品A中的土著微生物在14 d內(nèi)可將DBP徹底降解；當土樣中加入高效DBP降解菌JDC13作為外源菌后，DBP的降解速度明顯加快，僅在9 d內(nèi)就將DBP完全降解；樣品B與不接種外源菌的樣品A相比，降解時間縮短了5 d，這表明土壤中接種外源菌后可以迅速啟動DBP的生物降解，并加快其降解速度。根據(jù)Numerous模型[14]進行降解動力學分析，其降解動力學方程和相關(guān)系數(shù)（表1）表明樣品A和B對DBP的生物降解符合一級動力學反應模型。

圖1 土壤樣品A和B中DBP的生物降解曲線Fig.1 Biodegradation of DBP in soil for samples A and B

表1 樣品A和B對DBP生物降解動力學方程Table 1 Kinetic equation of DBP degradation in soil

2.2 土壤中細菌總數(shù)的動態(tài)變化

對樣品A和B細菌總數(shù)的變化情況進行研究。加入DBP 2 d后，未加降解菌的土壤樣品A中DBP降解了10.4%，細菌數(shù)量由5.3×107個/g減少到4.5×107個/g，說明土壤細菌對DBP有一定降解能力，但菌數(shù)減少說明外加DBP對土壤細菌有一定的抑制作用。而同時加入降解菌JDC13的土壤樣品B中在2 d內(nèi)DBP降解了51.8%，細菌數(shù)量由6.9×107個/g增加到1.02×108個/g，說明接種外源降解菌可以加快DBP的降解并減少DBP對土著細菌的抑制作用。樣品A中的細菌在被抑制2 d左右后開始繁殖生長，細菌數(shù)量增加，在第6天時達到最高菌數(shù)1.79×108個/g，然后，緩慢下降，在第9天之后趨于穩(wěn)定。樣品B中的細菌數(shù)量在第4天時達到最大值2.19×108個/g，然后，逐漸下降，在第6天后趨于穩(wěn)定。在趨于穩(wěn)定之后，樣品A和B中的細菌總數(shù)接近，表明在大部分DBP被降解后，降解菌JDC13對土壤中細菌總數(shù)無明顯影響。因此，與樣品A相比，樣品B中加入了外源降解菌JDC13，在培養(yǎng)初期土壤菌群就能夠更好地適應DBP，在含DBP的土壤中快速生長繁殖，直至DBP被完全降解為止。

2.3 土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

以樣品A和B不同時間點所提取的基因組DNA為模板，利用16Sr RNA V3區(qū)域引物進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析（圖2）。DGGE圖譜中的條帶類型顯示了樣品A和B不同時期優(yōu)勢細菌群落結(jié)果的變化情況。A0～A20及B0～B20分別為樣品A和樣品B在第0天到第20天所取樣品。

通過Quantity one軟件對土壤樣品A和B的細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果見圖2。圖2（a）表明樣品A和B在不同時期的細菌基因組DNA共存在46個不同條帶類型，其中樣品A和B分別擁有35個和38個不同位置的條帶，并且樣品A和B的DGGE圖譜存在明顯差異。加入DBP 2 d后，只加入DBP的樣品（A2）中出現(xiàn)了6個新的條帶，5個已有條帶消失；而加入DBP和降解菌JDC13的樣品（B2）中出現(xiàn)了5個新的條帶，3個消失，并且其條帶較亮的優(yōu)勢菌在樣品A和B中也存在明顯差異。樣品A在隨后的2～6 d條帶變化較小，第9天后又有5個新的條帶出現(xiàn)，已有條帶的亮度也有明顯變化，說明DBP的大量降解后細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。樣品B在每個時間段里都有一定變化，說明不同細菌之間的競爭比較明顯，但是，加入的降解菌JDC13的DNA條帶始終很亮，說明JDC13在土壤DBP降解過程中一直是優(yōu)勢種群之一。

圖2 土壤樣品A和B的細菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure of bacterial community in sample A and B

采用組平均法對DGGE圖譜進行聚類分析。由圖2（b）可見：在聚類重新標定距離為25的水平上，樣品A和B各取樣時間點分別聚為兩大類，且與第0天時的樣品（A0和B0）距離較遠。樣品A中，A2，A4和A6在標定距離小于4時聚為一類，其細菌群落差異較小，A14，A6和A9在標定距離為8～10時才與A2，A4和A6聚為一大類。樣品B中，B2，B6和B9在標定距離5左右聚為一類，B14和B20在標定距離為12時聚為一類，樣品B的所有取樣點在標定距離為16時聚為一大類。說明只加入DBP與同時加入DBP和JDC13對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響均十分明顯，而樣品A和B之間的細菌群落變化也存在明顯差異。

對DGGE圖譜中20個不同位置較亮的條帶（YL1～YL20）進行切膠測序，將所得序列提交到Genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號為GQ863464～GQ863483。 用Blaste軟件在Genebank數(shù)據(jù)庫中進行比對，并與相似序列通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：20個條帶可分為8大類群。YL4～YL11和YL14屬于β變形菌綱（Betaproteobacteria），共包含9個條帶，是最具優(yōu)勢的一大類；YL19和YL20屬于α變形菌綱（Alphaproteobacteria）；YL1屬于δ變形菌綱（Deltaproteobacteria）；YL12屬于γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）；YL13屬于黃桿菌綱（Flavobacteria）；YL18屬于酸桿菌綱（Acidobacteria）；YL12和YL15～YL17屬于放線菌綱（Actinobacteria），是第二大類優(yōu)勢菌；YL3屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）。β變形菌綱中與YL14和YL4相似的有Delftiasp.，γ變形菌綱中與YL12相似的有Pseudomonassp.，黃桿菌綱中與YL13相似的有Flavobacteriasp.，放線菌綱中與YL2相似的Mycobacteriumsp.，芽孢桿菌綱中與YL3相似的有Bacillussp.，從各類環(huán)境樣品中分離得到，可以有效降解PAEs類化合物[15?19]。樣品A在加入DBP后，其優(yōu)勢細菌種群發(fā)生了明顯的變化。第0天時原有較亮條帶屬于酸桿菌綱的YL18和屬于δ變形菌綱的YL1從第2天起消失。與此同時，一些優(yōu)勢細菌種群產(chǎn)生，如屬于芽孢桿菌綱的YL3、屬于放線菌綱的YL2以及Delftiasp. YL14等在第2天后出現(xiàn)，且條帶較亮。而屬于β變形菌綱的YL5～YL11和屬于黃桿菌綱的YL13一直都有條帶。樣品B在加入DBP和降解菌JDC13后，JDC13的條帶一直很亮，屬優(yōu)勢種群。另外，屬于放線菌綱的YL15、屬于β變形菌綱的YL7～YL11以及屬于酸桿菌綱的YL18在樣品B中條帶一直較亮。在第2天后新出現(xiàn)的優(yōu)勢細菌包括屬于α變形菌綱的YL19和YL20以及屬于放線菌綱的YL17和YL17等，而消失的條帶包括屬β變形菌綱的YL5和YL6以及屬于δ變形菌綱的YL1等。

圖3 用鄰接法構(gòu)建的樣品A和B中優(yōu)勢細菌16Sr RNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16Sr RNA sequence of dominant bacteria from samples A and B determined by NJ methods

3 討論

在受污染土壤中接種外源微生物進行生物強化，是生物修復過程中的一種重要手段。生物強化的研究主要有以下幾個方面[20]：（1） 與其他生物修復技術(shù)的降解效果相比較；（2） 研究接種的微生物演變情況；（3） 研究接種微生物對土著微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。本文研究從環(huán)境中篩選出的一株DBP高效降解菌JDC13進行生物強化的效果，主要從以下幾個方面進行分析：（1） 土壤中DBP殘留含量；（2） 土壤中細菌總量的動態(tài)變化；（3） 土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)的變化（包括接種外源細菌的變化情況）。

JDC13是從污染的河底污泥里分離得到的一株DBP高效降解菌。在無機鹽培養(yǎng)基中，它能夠在30 h內(nèi)完全降解8 mg DBP。選用JDC13作為外源降解菌接種到含0.8 mg/g DBP的土壤中，并與未加入JDC13的樣品進行對比培養(yǎng)，研究JDC13的生物強化效果。在培養(yǎng)進行的前2 d，只含有DBP的樣品A中細菌總數(shù)下降，DBP的降解速率十分緩慢（圖1）；而含有等量DBP并同時加入了降解菌JDC13的樣品B中細菌的總數(shù)量緩慢上升，DBP的殘留含量迅速下降。因此，DBP對土壤中的土著細菌有一定的抑制作用，使得樣品A中DBP降解緩慢。而加入了高效降解菌JDC13后，通過JDC13 對DBP的快速降解，大大降低了DBP對土著細菌的最初抑制，使得在最初2 d內(nèi)DBP的殘留量迅速下降。經(jīng)過前期適應后，樣品A和B中的細菌開始快速繁殖生長，加入的DBP也被迅速利用，樣品A和B中的細菌分別在第14天和第9天時幾乎將DBP 完全降解。加入JDC13的樣品B將DBP完全降解的時間提前了5 d。因此，接入JDC13進行生物強化修復具有很好的效果。

PCR-DGGE技術(shù)廣泛應用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。處于不同位置的每條DNA帶及其相對濃度（亮度）代表群落中某一種特定微生物及其在群落中的相對豐度[21]。一般認為PCR-DGGE只能分辨土壤中豐度為1%以上的微生物，因此，PCR-DGGE數(shù)據(jù)更適用于解釋土壤中優(yōu)勢細菌群落結(jié)構(gòu)[22]。在土壤中加入DBP后，由于特殊碳源的富集作用，會明顯改變土壤中細菌的優(yōu)勢種群構(gòu)成[23]。樣品A和B在DBP加入后，其細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤原有細菌群落相比發(fā)生了顯著的變化，且A和B之間的細菌群落變化也有明顯的差異（圖2）。DGGE條帶測序結(jié)果表明：樣品A中放線菌、β變形菌等在培養(yǎng)過程中處于優(yōu)勢地位，而原有的酸桿菌、δ變形菌等被淘汰；樣品B中，由于JDC13是一株DBP高效降解菌，進入土壤后它可以迅速利用DBP生長，在降解過程中成為土壤中的優(yōu)勢種群。另外，放線菌、α-變形菌以及部分β變形菌也為土壤中優(yōu)勢種群，δ變形菌、部分β變形菌等被淘汰。將土壤中優(yōu)勢細菌的測序結(jié)果與已報道的細菌來源進行追索，發(fā)現(xiàn)大部分優(yōu)勢細菌與PAEs降解相關(guān)，且部分為PAEs高效降解菌。因此，DBP的加入對土壤中能夠耐受和利用DBP的細菌類群起了選擇性富集作用。

4 結(jié)論

（1） 接種外源降解菌JDC13有利于土壤中DBP的降解，與直接用土壤中的土著微生物降解DBP相比，其完全降解0.8 mg/g DBP的時間提前了5 d。

（2） 在土壤中加入DBP， 在最初的一段時間內(nèi)會抑制土著微生物的生長。接種外源降解菌可以有效減少這種不利影響。

（3） 只加入DBP與同時加入DBP和外源降解菌JDC13都會顯著影響土壤中細菌群落的構(gòu)成，且二者的細菌群落變化也有明顯差異。

（4） 由于DBP對土壤中能夠耐受和降解DBP細菌的富集作用，JDC13以及放線菌、β變形菌等在DBP土壤降解過程中成為優(yōu)勢種群，大部分優(yōu)勢細菌測序序列與PAEs降解菌序列相似。

（5） 接種的外源降解菌JDC13可以促進DBP 的生物降解，因此，接種JDC13進行生物強化修復具有較好的效果。

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（編輯 陳燦華）

Biodegradation of DBP contaminated soil by high-efficiency degrading strain and dynamics analysis of bacterial community

WU Xue-ling, DAI Qin-yun, LIANG Ren-xing, WANG Yang-yang
（School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China）

An experiment was conducted in lab by adding di-n-butyl phthalate （DBP） soil with DBP alone and DBP plus DBP degrader JDC13. Biodegradation of DBP in soil, and its effect of the inoculant JDC13 on soil bacterial population and structure of soil bacterial community were studied. The DBP remaining in soil was determined by HPLC. In Sample A, with the only addition of DBP, the DBP was completely degraded after 14 d. And in Sample B, with the addition of DBP and JDC13, the DBP in soil was absolutely degraded after 9 d. Changes in the bacterial community were monitored using denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results show that JDC13 can enhance the biodegradation of DBP in soil. DBP can inhibit the growth of local soil bacteria, but inoculation with JDC13 can reduce the negative effect of DBP on local soil bacteria. DBP alone and DBP plus JDC13 substantially affect the structure of bacterial community in the soil. JDC13,ActinobacteriaandBetaproteobacteriabecome the dominant bacteria in the DBP-contaminated soil. And most of them are homologous to the Phthalate esters （PAEs） degrader.

DBP; biodegradation; bioaugmentation; PCR?DGGE; bacterial community

Q938.1; X53

A

1672?7207（2011）05?1188?07

2010?02?15；

2010?05?21

國家自然科學基金資助項目（30770388）

吳學玲（1965?），女，湖南常德人，博士，副教授，從事環(huán)境微生物學及生物冶金研究；電話：0731-88804873；E-mail： xueling0714@yahoo.com.cn