李琳，戈軍，曹健榮

·生物診斷技術·

甲型H1N1流感病毒（2009）及其核酸診斷試劑的研發(fā)與臨床應用

李琳，戈軍，曹健榮

流感是一種至今尚無法完全控制的急性呼吸道傳染病，可周期性地引起世界性大流行。自 20 世紀以來，有明確記載并有病原學依據的世界流感大流行一共有 4 次。其中發(fā)生于 1918 – 1919年[1-3]的西班牙大流感，由 H1N1 亞型流感病毒引起，這是目前所知最大的一次流感大流行，估計有2500 萬 ～ 4000 萬人死亡；發(fā)生于 1957 年的亞洲流感，由H2N2 亞型流感病毒引起，導致了數百萬人的死亡，H2N2病毒是由當時流行的 H1N1 病毒與禽流感病毒 H2N2 病毒重配而來；1968 年的香港流感是由 H3N2 病毒[4]引起，該病毒由禽流感病毒和當時流行的人流感病毒重配；1977 年 H1N1 亞型流感病毒在 20 年后重新出現，這次流感規(guī)模遠遠小于前幾次，其病毒就是 1957 年之前在人群中流行的 H1N1 病毒，但這種病毒如何在自然界存在，然后又重新爆發(fā)的機制尚不清楚，很難設想一種病毒在某種宿主中存在 20 年而沒有發(fā)生任何變異。

自 2009 年 3 月，墨西哥和美國先后發(fā)現了甲型 H1N1流感病毒感染病例[5-6]，隨后全球確診病例人數不斷上升。截至北京時間 6 月 15 日 23∶00，WHO 共接到 76 個國家累計報告甲型 H1N1 流感確診病例 35928 例，死亡163 人。截至 6 月 15 日 24 時，我國 18 個省份累計報告甲型 H1N1 流感確診病例 232 例。目前的數據顯示，甲型 H1N1 流感病毒已經具備了人際傳播的能力，人群對該病毒的免疫低下，因此病毒在人際之間的傳播能力較普通流感病毒更強。世界衛(wèi)生組織已經將該次甲型 H1N1 流感疫情的預警程度上升到 6 級[7]。

秋冬季節(jié)是流感極易流行的時期，有可能引起甲型H1N1 流感病毒的嚴重爆發(fā)。因此，建立甲型 H1N1 流感病毒的快速檢測方法，生產能廣泛用于臨床的、準確有效的實驗室診斷試劑盒勢在必行。

1 甲型 H1N1 流感病毒的分子生物學特征

流感病毒屬于正黏病毒科[8]，依據病毒表面的凝血素抗原（HA）共分 3 型，即甲（A）、乙（B）和丙（C）型流感病毒。甲型（A 型）流感病毒可以感染哺乳動物（人類、豬、雪貂、馬）以及鳥類。甲型流感病毒形態(tài)多樣，有球形、絲狀或不規(guī)則狀，中等大小，有囊膜。囊膜表面上突出的糖蛋白，通常稱為“纖突”，是主要的表面抗原，由血凝素（H）和神經氨酸酶（N）兩種組成，具有高變異特性。根據該兩種蛋白抗原性的差異甲型流感病毒又分不同種亞型[9-10]，迄今共發(fā)現 HA 亞型 16 種（H1 ～ H16），NA 亞型 9 種（N1 ～ N9）。甲型流感病毒是一種分節(jié)段 RNA 病毒，共含有 7 條結構蛋白基因和 1 條非結構蛋白基因（NS），結構蛋白分別為核蛋白（NP）、基質蛋白（M）、HA、NA、PA、PB1 和 PB2，其中前 4 種蛋白為病毒粒體的組成成分，后3 種蛋白均為功能性多聚酶，參與病毒基因的轉錄和復制，在病毒粒體中屬于分子量最大但含量極少的蛋白。NS 蛋白存在于受病毒感染的細胞中，病毒粒體中檢測不到，具體功能尚不清楚[11]。

根據美國疾病預防控制中心和 WTO 公布的流感病毒的基因組成信息，研究人員將甲型 H1N1 流感病毒的基因與已經掌握的部分豬流感病毒的基因進行了對比，利用流感病毒信息庫和快速分析平臺，對已報道的 22 株病毒序列進行分析，各分離株的核苷酸序列的同源性達到 99％ 以上，屬于同一株病毒[12]。對 HA 基因和 NA 基因進行分析，確認引起本次疫情的病原體屬于 A/H1N1 亞型流感病毒[13]。同時對病毒全部 8 條基因進行進一步分析，發(fā)現此次流行的病毒株包含一種較為獨特的基因片段組合，是來自北美和歐亞兩種豬流感病毒的混合體。

本次流行的流感毒株的 HA 基因核苷酸序列與早期從美國分離到的 H1N2的豬流感病毒株的同源性達到 93％以上，其中與印第安納州的 H1 亞型豬流感病毒[A/Swine/ Indiana/P12439/00（H1N2）]具有 95％ 的同源性。提示本次 A/H1N1 流感病毒的 HA 基因由北中美洲本地的豬流感病毒變異而來。NA 基因沒有發(fā)生核苷酸缺失，其序列具有歐亞株系豬流感病毒的特征。與之同源性在 90％ 以上的病毒都來源于歐亞地區(qū)的 H1N1 豬流感病毒，其中A/ Swine/England/195852/92（H1N1）、A/swine/Spain/WVL6/ 1991（H1N1）的核苷酸同源性達到了 94％。M 基因的核苷酸序列也與歐亞株系的豬流感病毒的同源性最高，達到96％。提示 NA 和 M 基因來源于歐亞株系的豬流感病毒。

這種來自北中美和歐亞兩種豬流感病毒的混合體是一種新型的 A/H1N1 病毒，以前從未發(fā)現在豬群中感染和流行，也從未在美國以及其他國家的豬流感和人流感病毒分離株中出現，GenBank 中也未有類似基因組合的病毒序列的報道。歐亞豬流感病毒通常僅在歐亞流行，還沒有報道說在人體內被發(fā)現過，人體對這種病毒缺乏免疫保護作用，這可能是此病毒快速傳播的原因之一。

2 流感病毒的實驗室檢測方法

衛(wèi)生部印發(fā)的《甲型 H1N1 流感診療方案（2009 年試行版第一版）》中，介紹了甲型 H1N1 流感病例的診斷標準。出現流感樣臨床表現，同時有以下一種或幾種實驗室檢測結果可判定為確診病例：①甲型 H1N1 流感病毒核酸檢測陽性；②分離到甲型 H1N1 流感病毒；③血清甲型 H1N1 流感病毒的特異性中和抗體水平呈 4 倍或 4 倍以上升高。目前常用的實驗室檢測方法有如下幾種。

2.1 抗原檢測

膠體金快速抗原檢測技術是目前臨床對流感病毒進行應用檢測的最常用方法[14]。該技術具有結果直觀、靈敏度高、快速等諸多優(yōu)點，直接取鼻咽拭子作為抗原檢測，20 min 可判斷結果，適于現場使用。但是該技術只能鑒別甲乙型流感病毒，不能確定亞型，具有一定的局限性。

2.2 血清學檢測

血清學檢測主要包括紅細胞凝集抑制試驗和微量中和試驗。紅細胞凝集抑制試驗的原理是利用血清中的抗體與病毒表面血凝素抗原的結合從而抑制病毒粒子與紅細胞結合而導致紅細胞不出現凝集的現象。微量中和試驗的原理是通過血清中中和抗體與活病毒反應而阻止病毒感染細胞，直觀地反映了細胞-病毒-抗體的相互作用。

血清學檢測需要急性期和恢復期兩份血清，急性期主要針對 IgM 進行抗體檢測，但 IgM 在體內維持時間短，且目前尚無成熟的針對 IgM 的特異性檢測方法。目前主要針對恢復期的 IgG 進行抗體檢測，診斷存在滯后性，對流感的預防沒有實際意義。因此血清學檢測方法主要用于流行病學分析和回顧性診斷[15-17]。

2.3 核酸檢測

2.3.1RT-PCR RT-PCR 是一種快速靈敏和特異的核酸RNA 檢測方法。能準確檢測到新甲型 H1N1 流感病毒多個特異性基因，區(qū)分出季節(jié)性 H1N1 流感病毒，適用于普通醫(yī)務和檢驗檢疫人員使用；多重 RT-PCR 檢測試劑盒，能夠多點、全面檢測到新甲型 H1N1 流感病毒的多個特異基因，適用于流感監(jiān)測機構和臨床[18]。

2.3.2熒光 PCR 法 熒光 PCR 技術是利用熒光染料在光刺激下釋放的熒光能量的變化來直接反映出 PCR 擴增產物量變化的核酸檢測技術，具有高度的靈敏性、特異性和精確性。該技術根據熒光作用方式分為：SYBR 熒光染料法、TaqMan 技術、分子信標和復合探針等類型，依據其各自優(yōu)缺點可將各技術方法分別應用于不同方面的科研工作中，以期得到最優(yōu)的檢測效率。它以特異性強、靈敏度高、重復性好、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具。

3 甲型 H1N1 流感病毒 RNA 檢測試劑盒（熒光PCR 法）的研究

3.1 技術原理

熒光 PCR 法是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定性分析的方法。

本產品所使用的熒光基團為 TaqMan 熒光探針。TaqMan 熒光探針的工作原理為：PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR 擴增時，Taq 聚合酶的 5′ – 3′ 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步。

從 GenBank 數據庫和中國國家流感中心病毒序列數據庫中下載豬源流感病毒 H1N1 和甲型流感病毒 H1N1、H3N2、H5N1 等亞型 M 基因、NP 基因和 HA 基因全序列，軟件比對分析所有甲型流感病毒 M 基因序列的一致性，選擇相對保守區(qū)設計引物和探針；將豬源 H1N1、新甲型 H1N1 和季節(jié)性甲型流感病毒 H1N1 所有 NP 基因和HA 基因序列放在一起比對，選擇相對保守區(qū)設計引物和探針。同時選擇人 RNaseP 基因作為內參，實時監(jiān)控整個樣本處理及 PCR 擴增過程。

3.2 產品的創(chuàng)新點

本產品采用熒光 PCR 法，具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，可使甲型 H1N1流感病毒在早期檢出。同時該法可重復性好，受人為影響小。本試劑盒中包含 4 對擴增引物（FluA、SWH1、SWFluA1 和內參 RNP）及探針，提高了檢測的特異性，可有效區(qū)分季節(jié)性流感和豬流感患者。本產品采用人工 RNA 假病毒作為陽性對照品，增強了陽性對照的穩(wěn)定性。

3.3 臨床意義

甲型 H1N1 流感病毒可經呼吸道傳染，傳播途徑與季節(jié)性流感類似，主要傳染源來自感染病毒的豬或人及隱性感染者，被甲型 H1N1 流感病毒污染的物品和環(huán)境也是潛在的感染來源。甲型 H1N1 流感病毒與流感、禽流感、上呼吸道感染、肺炎、SARS、傳染性單核細胞增多癥、巨細胞病毒感染、軍團菌肺炎、衣原體、支原體肺炎等在癥狀上很難鑒別。

采用甲型 H1N1 流感病毒 RNA 檢測試劑盒可對呼吸道等樣本中甲型 H1N1 流感病毒 RNA 進行定性檢測，可用于該病毒感染的實驗室輔助診斷和監(jiān)控，輔助判定流感樣癥狀病例是否感染甲型 H1N1 流感病毒。檢測結果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據。該產品技術方法處于國內領先水平，將改變我國目前甲型 H1N1 流感病毒檢測的嚴峻局面，能夠快速、準確地對甲型H1N1流感病毒進行檢測，具有極高的實用性和推廣價值。

4 小結

綜上所述，甲型 H1N1 流感毒株，是一種包含有豬流感、禽流感和人流感3 種流感病毒基因片段的新型流感病毒，該病毒在人際之間的傳播能力較普通流感病毒強。目前，關于甲型 H1N1 流感病毒的檢測試劑盒，國內外均無有批準文號的同類商品報道。由于熒光 PCR 方法具有較高的檢測靈敏度和特異性，使得甲型 H1N1 流感在早期即可檢出，有利于甲型 H1N1 流感預防控制工作。

由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所研制，北京金豪制藥股份有限公司負責產品產業(yè)化的甲型 H1N1 流感病毒 RNA 檢測試劑盒采用熒光 PCR 方法，保證了試驗結果的可重復性和減少人為操作影響。本試劑盒的成功開發(fā)與產業(yè)化為甲型 H1N1 流感診斷提供了便利。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.008

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2011-11-03