周云國，洪葵

·綜述·

DNA甲基化與心力衰竭

周云國，洪葵

心力衰竭（簡稱心衰）是危害人類健康的一類重要疾病，可明顯縮短壽命、降低患者生活質(zhì)量。雖然藥物治療可緩解患者癥狀，延長患者生命，但其發(fā)病率和病死率仍然居高不下。因此，探究心衰的分子機制及特異性治療措施已成為當今研究熱點，尤其是心衰表觀遺傳學改變的研究越來越受到重視，其中 DNA 甲基化備受關(guān)注。以往研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者雌激素受體 α（ER-α）等抗增殖基因高甲基化，使血管平滑肌異常增生，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[1]。11β-羥類固醇脫氫酶（11β-HSD2）選擇性地表達在醛固酮受體組織，主要作用就是抑制非選擇性鹽皮質(zhì)激素激活導致體內(nèi)鈉潴留，進而影響血壓的變化。編碼 11β-HSD2 的基因 HSD11B2 的啟動子區(qū)和第一個外顯子區(qū)高度甲基化，可使相應(yīng)組織和細胞的 11β-HSD2 表達減少。在體外人體細胞和大鼠體內(nèi)細胞中，使用去甲基化藥物 5-氮-2′-脫氧胞苷和普魯卡因胺可以促進 11β-HSD2 的轉(zhuǎn)錄，進而增強11β-HSD2 活性?？梢?，HSD11B2 基因的甲基化與高血壓有密切關(guān)聯(lián)[2]。雖然表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的修飾與心肌病理性增長、重構(gòu)以及心衰有關(guān)聯(lián)[3-4]，microRNA 能調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、壞死，可以改變心血管疾病中一些基因的表達，與心肌肥大以及心衰的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系[5-6]；但是對于 DNA 甲基化與心衰的關(guān)系卻知之甚少，而明確DNA 甲基化與心衰的關(guān)系問題，將有望為心衰提供一個新的治療策略。現(xiàn)本文就相關(guān)研究進展予以綜述。

1 DNA 甲基化及其作用

在基因組中除了 DNA 和 RNA 以外，還有許多調(diào)控基因的信息分子，它們雖然本身不改變基因的序列，但是可以通過對基因 DNA 和組蛋白的化學修飾、RNA 干擾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA 和其他分子的相互作用，而影響和調(diào)節(jié)基因的功能和特性，并且通過細胞分裂和增殖周期遺傳給后代，這就是表觀遺傳學（epigenetics）。其主要包括X 染色體劑量補償、DNA 甲基化、組蛋白密碼、基因組印記、表觀基因組學等[7]，其中以 DNA 甲基化研究最多。DNA 甲基化是表觀遺傳學中研究最為深入的一種機制，它是一種酶介導的化學修飾過程，即在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，將 1 個甲基添加至基因組 CpG 二核苷酸胞嘧啶的 5′-C 上，形成 5-甲基化胞嘧啶（5-methylcytosine）。DNA 甲基化主要發(fā)生在基因的啟動子區(qū)和第一個外顯子區(qū)的 CpG 島（CpG island）區(qū)域，CpG 島主要位于轉(zhuǎn)座子和基因啟動子區(qū)域，含有60％ ～ 70％ 的 CpG，CpG 與 GpC 的比值至少高于 0.6[8]。DNA 甲基化通常與轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)，DNA 甲基化后核苷酸順序未變，但基因表達卻受到明顯影響。DNA 甲基化調(diào)控基因表達的機制為：①干擾轉(zhuǎn)錄因子對 DNA 元件的識別和結(jié)合；②將轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 識別序列轉(zhuǎn)變?yōu)樽枰治锏淖R別序列；③ DNA 甲基化有利于招募染色質(zhì)重塑或修飾因子[9]。同時，DNA 甲基化隨著年齡的增長，其個體改變會出現(xiàn)明顯差異。如 Fraga 等[10]發(fā)現(xiàn)具有共同基因型的同卵雙生兒，在幼兒時 DNA 甲基化無明顯的差異，但是隨著年齡的增長其 DNA 甲基化明顯不同，并進而導致基因的差異性表達。

2 Ca2+-ATP 酶（SERCA）對心衰的作用

2.1 SERCA 與心肌正常收縮

心肌細胞的收縮由 L 型鈣通道 Ca2+內(nèi)流以及細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+釋放介導完成，影響細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+攝取的兩個關(guān)鍵因素是內(nèi)質(zhì)網(wǎng) SERCA 和磷酸受鈣蛋白（phospholamban，PLB）。SERCA 是一類高度保守的跨膜蛋白，由 SERCA1、SERCA2、SERCA3 三種高度同源基因編碼。SERCA1 主要存在于骨骼肌中，分 SERCA1a 和 SERCA1b 兩個亞型。SERCA3 主要存在于上皮內(nèi)皮系統(tǒng)中，對 Ca2+的親和力較低。SERCA2 也分為兩個亞型：① SERCA2a 主要在心肌和骨骼肌慢肌纖維中大量表達，表達量是其他組織的 10 ～50 倍；它是一種 P 型離子激活型 ATP 酶，當細胞內(nèi) Ca2+濃度 ＞ 10-7mol/L 時即被激活，通過消耗 ATP 從而將 Ca2+逆濃度梯度由細胞質(zhì)泵入至細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。② SERCA2b 被認為是一種管家基因，存在于體內(nèi)各種細胞中，其主要作用是維持細胞內(nèi) Ca2+濃度的穩(wěn)定。

2.2 SERCA2a與心衰

心肌細胞在一次收縮后細胞質(zhì)內(nèi)大部分的 Ca2+通過SERCA2a 被泵回至細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，少部分經(jīng) Na+-Ca2+交換和肌細胞膜表面的鈣泵排至細胞外。SERCA2a 的水平是Ca2+濃度穩(wěn)定和心肌收縮的重要決定因子，其對于心肌舒張和 Ca2+存儲的補充以及心肌再次收縮和收縮功能都具有重要作用。研究顯示，SERCA2a 在心肌中表達量的升高或降低與心功能的改變成正相關(guān)[11]。SERCA2a 蛋白的表達量可直接影響心肌的正常功能，而其表達量則決定于SERCA2a 基因的表達。很多研究證實心衰晚期 SERCA2a 的 mRNA 和蛋白減少；動物心衰模型以及人類心衰心肌中也均可見 SERCA2a 表達下降[12-13]。Schultz 等[14]研究認為SERCA2a 的降低可以促進心衰，SERCA2a 在增強心功能的同時還可抑制心肌重構(gòu)。心臟移植晚期患者的 SERCA2a轉(zhuǎn)運功能明顯下降，研究數(shù)據(jù)顯示當抑制 SERCA2a 蛋白量及其活性降低至某一臨界數(shù)值時（例如蛋白量及其活性降低 35％ 時）即可以促進心衰的發(fā)生發(fā)展。但是關(guān)于SERCA2a 與心衰發(fā)生的因果關(guān)系及其具體機制尚有待研究探討。

2.3 腫瘤壞死因子與心衰

在過去的 20 多年里，大量研究證明炎癥反應(yīng)是慢性心衰疾病惡化的一個重要原因，并在心衰發(fā)病機制中占有重要作用[15]。心肌能合成細胞因子，從而導致體內(nèi)炎癥反應(yīng)維持在低水平狀態(tài)，因此這些細胞因子的濃度水平可提示疾病的預(yù)后；然而包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在內(nèi)的細胞因子活性抑制劑的臨床療效卻始終不甚理想[16]。TNF-α 濃度在各種心血管疾病的心肌和血液中均明顯升高，心功能I 級患者的 TNF-α 濃度低于心功能 II、III 級患者；此外，TNF-α 與射血分數(shù)、心功能、冠心病、慢性腎衰竭等變量成負相關(guān)，可以作為穩(wěn)定性心衰患者病情嚴重性和病死率的獨立評估因素[17]。Kubota 等[18]在實驗中將能編碼 TNF 受體 IgG（TNFRI）融合蛋白的腺病毒經(jīng)靜脈注入 6 周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，導致 TNFRI 在血漿和心肌中高表達，結(jié)果心肌炎癥反應(yīng)明顯降低，同時心肌內(nèi)細胞間黏附分子-1 （intercellular adhesion molecule-1）以及細胞因子 IL-β、MCP-1 等表達受阻，SERCA2a 和受磷蛋白濃度顯著上調(diào)，從而使左心室直徑增大發(fā)生逆轉(zhuǎn)。此外，TNF-α 還可下調(diào)SERCA2a 的表達，影響 Ca2+濃度的穩(wěn)定，而通過應(yīng)用抗TNF藥物治療可以逆轉(zhuǎn) SERCA 的表達，但是關(guān)于 TNF 下調(diào) SERCA2a 表達的具體機制尚不明確[18-19]。

3 相關(guān)基因甲基化與心衰

基因啟動子區(qū)域 CpG 島的甲基化可以通過與轉(zhuǎn)錄因子競爭或者干擾轉(zhuǎn)錄因子的正常結(jié)合而抑制基因轉(zhuǎn)錄，SERCA2a 的近端啟動子區(qū)域含有 CpG 島，CpG 島的甲基化可以調(diào)控 SERCA2a 蛋白的表達和活性進而影響心肌Ca2+濃度的穩(wěn)定性以及心肌功能。最近研究發(fā)現(xiàn) TNF-α 是通過促使 SERCA2a 啟動子區(qū)甲基化而抑制 SERCA2a 基因的表達，進而導致 SERCA2a mRNA 及其蛋白表達下降以及鈣瞬變的減少，破壞細胞內(nèi) Ca2+濃度的穩(wěn)定性，促進心衰，而甲基化抑制劑則可明顯降低這種由 TNF-α 所介導的高甲基化作用[20]，同時此結(jié)果也表明，抑制 TNF-α 介導的高甲基化作用今后將有可能成為治療心衰的一個新策略。另外，最近 Movassagh 等[21]在實驗中研究分析了心衰晚期患者心臟移植手術(shù)后的心臟組織樣本，并將其與同齡因交通事故死亡者的健康心臟組織樣本進行了比較，其中 6 例來源于交通事故死亡的正常男性心臟的左心室組織作為正常對照組，8 例因心肌病晚期導致心衰而進行心臟移植手術(shù)的男性患者心臟的左心室組織作為實驗組，提取 2 組基因組 DNA，進行 qPCR、免疫沉淀實驗檢測，結(jié)果鑒定出與3 個心肌病差異性 DNA 甲基化區(qū)域有關(guān)的 3 個基因，即AMOTL2、ARHGAP24 和 PECAM1；然后采用 qPCR 技術(shù)檢測它們的轉(zhuǎn)錄物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組與正常對照組比較，這 3 個血管生成相關(guān)性基因位點的 DNA 甲基化率差異具有統(tǒng)計學意義：①實驗組 PECAM1 基因的 5' 端區(qū)域甲基化率明顯高于對照組，而其 PECAM1 基因的表達下降；②實驗組 AMOTL2 基因的基因主體低甲基化，AMOTL2基因表達下降；③實驗組 ARHGAP24 基因的基因主體高甲基化，相應(yīng)的基因表達也升高。可見，PECAM1 基因甲基化率與該基因的表達成負相關(guān)，AMOTL2 和 ARHGAP24基因的甲基化與該基因的表達成正相關(guān)。進一步分析左心室組織這 3 個基因的基因表達與差異甲基化的關(guān)系，正如預(yù)想結(jié)果，5' 端區(qū)域甲基化與基因表達成負相關(guān)，基因的甲基化與基因表達成正相關(guān)。重要的是，雖然 AMOTL2 和ARHGAP24 基因在擴張型心肌病中的基因表達相反，但是兩者的甲基化和基因表達成正相關(guān)。

4 展望

已有動物模型實驗研究證明，小鼠基因甲基化與心衰相關(guān)[20]；而盡管人類疾病研究也發(fā)現(xiàn)心衰患者與健康人群心肌的甲基化狀態(tài)明顯不同[21]，但關(guān)于甲基化與心衰的關(guān)系還有諸多疑點有待進一步研究解決。例如，Kao 等[20]雖然研究探討了 TNF-α 對心房心肌細胞的作用，但也有可能TNF-α 對心室肌細胞的作用與其不同；而且這僅為體外實驗結(jié)果，體內(nèi)實驗結(jié)果尚屬未知；此外，TNF-α 只有在較高濃度（50 ng/ml）才可以誘發(fā) DNA 甲基化，并且實驗采用小鼠心肌細胞，人體心肌細胞結(jié)果同樣未知。Movassagh 等[21]實驗雖然發(fā)現(xiàn)心衰患者心臟與正常人群心臟 DNA 甲基化存在差異，但尚無法證實 DNA 甲基化與心衰具有因果關(guān)系。而 DNA 甲基化可能是環(huán)境、飲食與心衰和其他疾病發(fā)展的中間環(huán)節(jié)之一[10, 21]，是外因和內(nèi)因的綜合結(jié)果[10]。上述種種均需要我們在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上更深入地進行探索闡釋，同時進一步明確具體哪些基因的高甲基化或低甲基化與心衰的發(fā)生發(fā)展相關(guān)?？上驳氖牵F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)基因DNA 甲基化與心衰相關(guān)，這必將為今后心衰臨床治療提供新的靶點。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.014

330006 南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科

洪葵，Email：hongkui88@163.com

2011-05-12