王明宇，楊 宇，吳 江

近年來(lái)，線粒體功能障礙(Mitochondrial dysfunction)對(duì)包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的影響日益引起科研人員的關(guān)注。Aβ結(jié)合乙醇脫氫酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)是一種能與β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)特異性結(jié)合的線粒體酶，諸多的研究結(jié)果顯示ABAD與AD的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，本文就其研究進(jìn)展綜述如下。

1 線粒體損傷與AD

線粒體損傷對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響日益引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，在與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、Friedrich 共濟(jì)失調(diào)(Friedrich ataxia，F(xiàn)RDA)，都能夠發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙的證據(jù)［1］。線粒體被稱為真核細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”(power houses)，其基質(zhì)和內(nèi)膜處含有三羧酸循環(huán)的酶類(lèi)和多種呼吸鏈復(fù)合體，是細(xì)胞能量代謝的主要結(jié)構(gòu)。Rhein等［2］培養(yǎng)了三聯(lián)(含APPsw、PS2和tau)轉(zhuǎn)基因AD鼠并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，有24種蛋白水平顯著下調(diào)，其中1/3為線粒體相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷是AD的早期指標(biāo)，其相關(guān)指標(biāo)的改變?cè)缬诓±韺W(xué)改變［3］。然而，這些改變是AD的原因還是結(jié)果，尚需進(jìn)一步研究論證。AD時(shí)線粒體的主要改變有:(1)三羧酸循環(huán)相關(guān)酶，如丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、α 酮戊二酸脫氫酶(αketoglutarate dehydrogenase，KGDH)等活性顯著下降［4，5］;(2)呼吸鏈復(fù)合體活性降低，ATP合成減少［6］;(3)電壓依賴型陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)受損;(4)線粒體源性過(guò)氧化氫和超氧化物產(chǎn)生增加等。

在臨床或動(dòng)物研究中，這些變化可以通過(guò)應(yīng)用正電子發(fā)射斷層攝影技術(shù)(positron emission tomography，PET)得以反映［7～9］，通過(guò)對(duì)局部腦組織生化代謝的觀察，可以有效地評(píng)價(jià)認(rèn)知功能下降的程度。

2 β-淀粉樣肽與AD

β-淀粉樣肽是APP的代謝產(chǎn)物之一，由39～43個(gè)氨基酸殘基組成，是構(gòu)成老年斑核心和血管壁沉積物的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，加入micromolar水平的Aβ就能夠通過(guò)多種機(jī)制直接損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能［10，11］。以往認(rèn)為，Aβ存在于神經(jīng)元之外，通過(guò)由可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，引發(fā)一系列細(xì)胞損傷過(guò)程，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。近些年來(lái)，隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了Aβ在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的存在［12，13］。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Aβ與線粒體損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。1997年，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，Yan等［14］發(fā)現(xiàn)了一種位于線粒體基質(zhì)內(nèi)并可以與Aβ特異性結(jié)合的乙醇脫氫酶，并最終將其命名為Aβ結(jié)合乙醇脫氫酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)。ABAD 是由 261個(gè)氨基酸組成的線粒體酶，由Xp11.2染色體HADH2基因編碼。ABAD的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在正常人組織中幾乎無(wú)所不在，其中在肝臟和心臟中表達(dá)最多，在腦組織則主要在神經(jīng)元中表達(dá)。

3 ABAD與AD

3.1 ABAD 生理功能

生理狀態(tài)下，ABAD通過(guò)與NAD或泛醌還原系統(tǒng)結(jié)合參與細(xì)胞內(nèi)的電子鏈傳遞和氧化還原過(guò)程。研究證實(shí)，ABAD在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和對(duì)抗應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，作為短鏈脫氫酶超家族成員，ABAD能夠可逆性地催化一系列NAD/NADH依賴的氧化還原反應(yīng)，其底物非常廣泛，包括線性乙醇、類(lèi)固醇類(lèi)(如17β-雌二醇)、S-乙酰乙酰輔酶A和β-羥丁酸等［15，16］。但生理?xiàng)l件下ABAD的催化作用在線粒體中并非處于主導(dǎo)地位。例如，ABAD和D-β-羥丁酸脫氫酶(D-b-hydroxybutyrate dehydrogenase)都能夠催化線粒體D-β-羥丁酸，但是后者與D-β-羥丁酸反應(yīng)的Vmax大約是ABAD的1000多倍。也就是說(shuō)，當(dāng)體內(nèi)局部?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定時(shí)，ABAD對(duì)β-羥丁酸的代謝作用微乎其微。然而，當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于缺血或營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)，即當(dāng)β-羥丁酸成為維持代謝穩(wěn)態(tài)的主要底物時(shí)，ABAD表現(xiàn)出顯著的催化活力。研究人員用去除葡萄糖、以β-羥丁酸作為主要能量底物的培養(yǎng)液培養(yǎng)COS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2～4d后出現(xiàn)細(xì)胞活力喪失和ATP水平迅速下降。而在同樣條件下，過(guò)表達(dá)ABAD的COS細(xì)胞則較好地保持了細(xì)胞活力和ATP濃度。隨后在培養(yǎng)基中加入［13C］D-β-羥丁酸并進(jìn)行核磁共振分光檢測(cè)(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy，NMR spectroscopy)研究，發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)ABAD的COS細(xì)胞中，乙酰輔酶A在三羧酸循環(huán)中的水平明顯升高［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)，ABAD可以具有與線粒體伴侶分子cyclophilin D結(jié)合的能力。cyclophilin D是一種肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶，當(dāng)其轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜時(shí)可被激活，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(membrane permeability transition pore，MPT)［17］開(kāi)放，破壞線粒體功能。ABAD 與 cyclophilin D［18～20］結(jié)合后可以抑制其向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

另一方面，當(dāng)編碼動(dòng)物或人的ABAD基因發(fā)生缺陷時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)ABAD對(duì)生物體的生存與發(fā)育具有極其重要的作用。當(dāng)果蠅的ABAD同系物scully基因發(fā)生點(diǎn)突變時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)其生殖能力嚴(yán)重下降，顯微研究顯示突變的精母細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)脂質(zhì)包涵體，伴有線粒體數(shù)量顯著減少，體積變小并出現(xiàn)線粒體嵴腫脹［21］。Lenski等［22］報(bào)道了一個(gè)在 ABAD 192位殘基發(fā)生同義突變的家族，該突變使該家族四代成員ABAD表達(dá)水平降低，并出現(xiàn)伴X染色體遺傳的精神遲滯、手足徐動(dòng)癥和行為異常等癥狀。

3.2 ABAD在AD中的作用

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ABAD在AD中表達(dá)明顯增多。用特異性抗ABAD抗體對(duì)尸檢腦組織進(jìn)行Wsetern blot分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AD患者ABAD蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生AD時(shí)，ABAD在腦組織神經(jīng)元，特別是Aβ聚集附近處表達(dá)升高。Lue等應(yīng)用免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，ABAD在AD腦顳葉和海馬中的表達(dá)比對(duì)照組分別高28%和40%。而不受AD影響的部位，如小腦，其ABAD表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。應(yīng)用共聚焦顯微觀察和免疫金電鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ和ABAD共同定位與受AD影響的腦組織的線粒體基質(zhì)中［23］。為明確線粒體中Aβ-ABAD的相互作用給神經(jīng)元帶來(lái)的影響，研究人員培養(yǎng)了過(guò)表達(dá)mAPP和人ABAD(Tg mAPP/ABAD)的轉(zhuǎn)基因小鼠［23，24］，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 Aβ 和ABAD在Tg mAPP/ABAD小鼠線粒體中的相互結(jié)合。在對(duì)神經(jīng)元中的研究中發(fā)現(xiàn)［25］，Aβ和ABAD顯著加重了Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，Tg mAPP/ABAD小鼠與Tg mAPP小鼠相比，前者表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶損害。在出生后4.5～5個(gè)月時(shí)，當(dāng)Tg mAPP小鼠、Tg ABAD小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力尚表現(xiàn)正常時(shí)，Tg mAPP/ABAD小鼠已經(jīng)表現(xiàn)出了嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶損傷。在Tg mAPP/ABAD小鼠8～10個(gè)月齡時(shí)，檢測(cè)其海馬CA1層區(qū)域性興奮性突觸后電位，可以發(fā)現(xiàn)其基礎(chǔ)突觸傳遞和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的損傷。以上結(jié)果均證實(shí)ABAD加重了Aβ誘導(dǎo)的毒性作用。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在AD腦組織勻漿和線粒體提取物中，Aβ和ABAD可以結(jié)合成一個(gè)38KD的復(fù)合體。而在對(duì)照組中，這種復(fù)合體含量極少［25］。體外結(jié)合研究表明，Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ1-20都可以以劑量依賴的方式與ABAD結(jié)合，而Aβ25-35不能與ABAD結(jié)合，這說(shuō)明ABAD與Aβ之間的結(jié)合并不是非特異性的。也提示Aβ可能是通過(guò)其N(xiāo)末端結(jié)合 ABAD，而保留其 C末端，使之能與更多的 Aβ結(jié)合［23］。利用高分辨率結(jié)晶攝影技術(shù)(High-resolution crystallography)對(duì)Aβ-ABAD復(fù)合體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在Aβ存在的條件下，NAD輔助因子失去了與ABAD結(jié)合的能力，這說(shuō)明Aβ使ABAD結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常改變。Aβ與ABAD的結(jié)合誘導(dǎo)了ABAD天然結(jié)構(gòu)中與其活性密切相關(guān)的 LD、LE、LF環(huán)和NAD結(jié)合部位發(fā)生大量的結(jié)構(gòu)畸變。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與NADABAD的結(jié)晶相比較，LD環(huán)的結(jié)構(gòu)異常是Aβ-ABAD復(fù)合物所獨(dú)有的。到目前為止，ABAD是唯一可以與Aβ結(jié)合的NAD依賴的短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族成員。研究人員發(fā)現(xiàn)，與其他SDR成員相比，ABAD的LD環(huán)中包含一個(gè)特有的插入序列(殘基95-113)，這個(gè)獨(dú)特的插入序列被認(rèn)為是Aβ的識(shí)別位點(diǎn)。為了進(jìn)一步證實(shí)LD環(huán)對(duì)Aβ結(jié)合的特異性，研究人員通過(guò)包含該區(qū)域(92-120殘基)的人ABAD肽(ABAD-DP)，應(yīng)用表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振技術(shù)來(lái)檢測(cè)它是否具有抑制Aβ與完整ABAD結(jié)合的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABAD-DP能夠抑制Aβ40和Aβ42與完整 ABAD的相互結(jié)合，而含有相同氨基酸成分，但序列相反的肽ABAD(120-92)或ABAD反向肽(ABAD reversed peptide，ABAD-RP)則被證明不具有這種抑制能力。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，ABAD的LD環(huán)對(duì)于ABAD同Aβ的結(jié)合是至關(guān)重要的［23］。

上述實(shí)驗(yàn)表明，ABAD可以加劇 Aβ的毒性作用，而ABAD-DP可以通過(guò)特異性地結(jié)合Aβ，避免Aβ-ABAD復(fù)合體的形成，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。利用基因融合技術(shù)，研究人員在ABAD-DP的N末端融合HIV-1 TAT蛋白的膜轉(zhuǎn)導(dǎo)域，使其能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，以利于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［26，27］。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該融合肽ABAD-DP可以進(jìn)入到神經(jīng)元線粒體中。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ABAD-DP加入到Tg mAPP/ABAD小鼠的神經(jīng)元培養(yǎng)基后，抑制了神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，特別是抑制了超氧陰離子和過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，而ABAD-RP組沒(méi)有出現(xiàn)這種改變。不同的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ABAD-DP可以顯著減少Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性作用，減少線粒體細(xì)胞色素c釋放、ROS的產(chǎn)生和神經(jīng)元的凋亡［23，24］。這說(shuō)明，干擾ABAD-Aβ的相互作用，能夠保護(hù)Aβ介導(dǎo)的線粒體和神經(jīng)元損傷。

綜上，不難看出Aβ結(jié)合乙醇脫氫酶是一把“雙刃劍”。在Aβ不存在時(shí)，ABAD對(duì)機(jī)體發(fā)揮多重保護(hù)作用。在應(yīng)激條件下，這種保護(hù)作用尤為顯著。作為一種多功能酶，ABAD的保護(hù)作用涉及多種機(jī)制，如對(duì)多種底物的催化作用，對(duì)異亮氨酸和支鏈氨基酸的分解代謝，對(duì)糖代謝和呼吸鏈的維持等，實(shí)驗(yàn)表明，ABAD的過(guò)度表達(dá)改善了缺血和帕金森病動(dòng)物模型的病理?yè)p害。然而，當(dāng)ABAD與過(guò)量的Aβ發(fā)生接觸時(shí)，這些對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用發(fā)生了戲劇性地逆轉(zhuǎn)。體外研究表明，在純化的ABAD中加入micromolar水平的Aβ40就能夠抑制它的催化活性。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物亦研究證實(shí)，Tg APP/ABAD雙轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知下降程度和病理學(xué)損害都要明顯重于Tg APP單轉(zhuǎn)基因鼠。ABAD與Aβ的相互作用使ABAD結(jié)構(gòu)發(fā)生畸變，失去了同NAD結(jié)合位點(diǎn)，ABAD活性被抑制，喪失了催化同多種底物的能力和對(duì)異亮氨酸與支鏈氨基酸的分解代謝作用。這種改變將導(dǎo)致:(1)產(chǎn)生大量有害的中間代謝產(chǎn)物，例如MHB等。這些中間代謝產(chǎn)物的積聚，干擾了三羧酸循環(huán)的正常過(guò)程，破壞了線粒體呼吸鏈的穩(wěn)定，導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體，特別是復(fù)合體 IV(cytochrome Oxidase，COX)活力下降，引起ATP產(chǎn)生不足;(2)ABAD與Aβ的相互作用可能取代了其與cyclophilin D的結(jié)合，導(dǎo)致后者轉(zhuǎn)位至線粒體內(nèi)膜，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPT)開(kāi)放，破壞線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能;(3)還有學(xué)者認(rèn)為ABAD的失活影響了其對(duì)雌激素類(lèi)物質(zhì)的代謝，從而影響后者的神經(jīng)保護(hù)作用。

最終，這些改變都會(huì)引起線粒體功能障礙，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，最終導(dǎo)神經(jīng)元死亡。但是到目前為止，精確的機(jī)制還未能完全闡明，尚有待于進(jìn)一步探索。

4 展望

對(duì)ABAD的深入研究，也為我們治療AD提供了新的思路。我們認(rèn)識(shí)到，抑制Aβ和ABAD的相互作用，就能夠達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。在這一點(diǎn)上，不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了有益的嘗試［28，29］。將ABAD-DP作為藥物亦為一種有效可行的治療方式［30］。但目前存在的問(wèn)題是，合成的短肽存在價(jià)格昂貴、半衰期短的缺點(diǎn)，以至于不能高效特異地與Aβ42結(jié)合而發(fā)揮其作用，從而限制了其臨床應(yīng)用。我們課題組構(gòu)建了融合ABAD-DP和人硫氧化還原蛋白1(human thioredoxin-1，hTRX)的慢病毒載體，實(shí)現(xiàn)了其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，并證實(shí)了其對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用［29］。應(yīng)用基因技術(shù)，使治療肽以一種經(jīng)濟(jì)、有效、穩(wěn)定、安全的方式發(fā)揮治療作用，將為未來(lái)阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的治療帶來(lái)希望。

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