鄭書(shū)香,王榮柱,謝松霖,何軍邀,王 普

(浙江工業(yè)大學(xué) 1.健行學(xué)院,2.藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

甾類藥物生物脫氫技術(shù)研究新進(jìn)展

鄭書(shū)香1,王榮柱2,謝松霖2,何軍邀2,王 普2

(浙江工業(yè)大學(xué) 1.健行學(xué)院,2.藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

甾類藥物是醫(yī)藥工業(yè)中重要的一大門(mén)類,通常以甾體母核結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),通過(guò)化學(xué)法或生物法合成,其中微生物轉(zhuǎn)化是許多甾類藥物或其中間體合成路線中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。此文對(duì)甾類藥物生物轉(zhuǎn)化脫氫反應(yīng)涉及的催化劑類型、轉(zhuǎn)化率提高的途徑、新型生物脫氫反應(yīng)體系等方面進(jìn)行了綜述。

甾類藥物;微生物轉(zhuǎn)化;脫氫反應(yīng)

甾體類藥物是醫(yī)藥工業(yè)中重要的一大門(mén)類,具有抗過(guò)敏、抗休克、抗病毒等作用,被廣泛用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、腫瘤、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、肌松等。

甾類藥物通常以甾體母核結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),通過(guò)化學(xué)法或生物法合成。微生物轉(zhuǎn)化法具有成本低、副產(chǎn)物少、對(duì)環(huán)境污染低等優(yōu)點(diǎn),故甾類合成中越來(lái)越多引入生物轉(zhuǎn)化法。目前,微生物轉(zhuǎn)化甾類藥物中涉及較多的是羥基化、還原、脫氫、芳構(gòu)化、邊鏈切除等。本文就甾類藥物生物轉(zhuǎn)化脫氫反應(yīng)體系所涉及的催化劑類型、如何提高轉(zhuǎn)化率,以及新型脫氫反應(yīng)體系進(jìn)行綜述。

1 生物催化劑類型

1.1 游離細(xì)胞

在兩相體系或單相體系中,將游離細(xì)胞直接作為生物催化劑的研究最為普遍,它不僅操作簡(jiǎn)便,而且游離細(xì)胞可維持較高酶活,利于輔酶再生[1]。張藝等[2]研究了含有不同基團(tuán)的甾體底物在不同反應(yīng)體系中的生物脫氫規(guī)律,結(jié)果表明,保持細(xì)胞的完整性對(duì) C1,2位脫氫轉(zhuǎn)化至關(guān)重要,細(xì)胞破碎會(huì)破壞細(xì)胞膜限制性酶,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的降低。

1.2 固定化細(xì)胞

在有機(jī)溶劑-水或離子液體-水兩相體系中的甾體脫氫研究中,將固定化細(xì)胞作為催化劑,不僅利于生物催化劑與產(chǎn)物的分離以及細(xì)胞的重復(fù)使用,還可降低有機(jī)溶劑等對(duì)細(xì)胞的毒性,維持酶的活性。Park等[3]利用不同疏水性凝膠固定化簡(jiǎn)單節(jié)桿菌,研究凝膠的疏水性對(duì)催化氫化可的松脫氫反應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠的疏水性越大,底物越易進(jìn)入到疏水區(qū)域,這可減少底物抑制,提高轉(zhuǎn)化率。張瑛等[4]探索了不同方法制備固定化簡(jiǎn)單節(jié)桿菌催化醋酸可的松,發(fā)現(xiàn)用聚乙烯醇-海藻酸鈣復(fù)合甾體包埋的細(xì)胞,具有機(jī)械強(qiáng)度高和酶活較高的優(yōu)點(diǎn),在最適溫度 34℃、最適 pH 7.5條件下,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?20 g/L時(shí),反應(yīng) 18～20 h,轉(zhuǎn)化率達(dá) 98%。

1.3 解凍細(xì)胞

Smolders等[5]以熱干和解凍的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌細(xì)胞為生物催化劑,研究了微乳體系中高濃度 16-甲基-萊氏化合物 S-21-醋酸酯 (16MRSA)的脫氫反應(yīng),發(fā)現(xiàn)解凍細(xì)胞在轉(zhuǎn)化 14～16 h后轉(zhuǎn)化率可達(dá) 98%,細(xì)胞干重濃度分別為 40 g/L,而熱干細(xì)胞轉(zhuǎn)化相同時(shí)間的干重僅為 10 g/L。

1.4 轉(zhuǎn)基因表達(dá)

簡(jiǎn)單節(jié)桿菌 3-甾酮-1-脫氫酶 (KSDH)也稱甾體 C1,2位脫氫酶,編碼該酶的全基因序列已被測(cè)出,許多學(xué)者將其克隆到其他菌種中,以提高該酶的基因表達(dá)量等。李玉等[6]將其重組到大腸桿菌中,超聲破碎的細(xì)胞破碎液對(duì) 4-烯-雄甾-3,17-二酮 (4-AD)的轉(zhuǎn)化率較簡(jiǎn)單節(jié)桿菌提高了近 10倍。

1.5 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

甾體脫氫酶多為胞內(nèi)酶,細(xì)胞壁 (細(xì)胞膜)通透性將成為影響傳質(zhì)的主要障礙,采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)有助于克服這一困難。張藝等[2]研究了簡(jiǎn)單節(jié)桿菌原生質(zhì)體催化甾體脫氫,發(fā)現(xiàn)以醋酸氫化可的松為底物的脫氫轉(zhuǎn)化率較高,而其他甾體化合物如可的松、甲睪酮和睪丸素等轉(zhuǎn)化率很低,其原因在于原生質(zhì)體在高滲液中不穩(wěn)定、易破裂,從而造成脫氫酶釋放被稀釋,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。采用原生質(zhì)體進(jìn)行甾體脫氫的報(bào)道較少,且轉(zhuǎn)化效果不理想。而利用原生質(zhì)體進(jìn)行甾體羥基化反應(yīng)的報(bào)道相對(duì)較多,且轉(zhuǎn)化效果較好。

1.6 高產(chǎn)菌株的篩選

王敏等[7]和趙榮等[8]利用原生質(zhì)體紫外線誘變結(jié)合底物抗性篩選方法選育得到高產(chǎn)菌株,氫化可的松轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到 73.6%和 81.63%,較出發(fā)菌株分別提高了 54%和14.1%。

2 改進(jìn)反應(yīng)體系以提高轉(zhuǎn)化率

2.1 溫度

溫度是影響酶或細(xì)胞催化的生物反應(yīng)的重要因素之一。葛翔等[9]利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌對(duì)甲基可的松進(jìn)行脫氫研究,發(fā)現(xiàn)在 30～37℃間,底物轉(zhuǎn)化率先隨著溫度的升高而增加,之后隨著溫度的繼續(xù)升高而降低,在 33℃左右,底物轉(zhuǎn)化率達(dá)較高值。酶反應(yīng) (細(xì)胞催化實(shí)質(zhì)上也是酶反應(yīng))速率是隨反應(yīng)溫度上升而增加,但同時(shí)酶變性的速率也會(huì)增加;當(dāng)溫度超過(guò)某點(diǎn) (最適溫度)時(shí),酶變性引起的速率下降量會(huì)超過(guò)本身因溫度上升引起的速率增加量,據(jù)此,通過(guò)考察不同溫度對(duì)生物催化劑催化底物脫氫的影響可確定其最適反應(yīng)溫度。

2.2 pH

pH對(duì)酶或細(xì)胞催化的生物反應(yīng)的影響與溫度類似。葛翔等[9]發(fā)現(xiàn)在 pH為 7.0附近處底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值(52%);當(dāng) pH分別為 3.0和 10.5時(shí),轉(zhuǎn)化率都接近于零。王普等[10]優(yōu)化簡(jiǎn)單節(jié)桿菌 17α-羥基 -16β-甲基 -孕甾 -4,9(11)二烯-3,20-二酮脫氫酶產(chǎn)酶條件時(shí),發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為 7.0時(shí),酶活力最高。酶催化時(shí)主要靠活性部分的催化基團(tuán)和底物結(jié)合基團(tuán),pH是通過(guò)改變這些基團(tuán)的帶電性質(zhì)從而影響酶促反應(yīng)過(guò)程的。一般甾體脫氫酶催化反應(yīng)的最適 pH值接近中性,大部分為 6～8。

2.3 增加底物溶解度

2.3.1 改進(jìn)底物投料方式 目前甾體脫氫反應(yīng)遇到的最大困難在于底物在水中的溶解度極低。底物難溶不但會(huì)造成產(chǎn)量的低下,有時(shí)還會(huì)引起反應(yīng)速率慢和轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題。有人從改進(jìn)底物投料方式以提高轉(zhuǎn)化率,葛翔等[9]測(cè)定的6α-甲基可的松的飽和溶解度為 0.172 g/L,通過(guò)將底物進(jìn)行超聲波粉碎,乳化后投料進(jìn)行微生物脫氫,以減少有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害作用,減少底物從固相到液相的傳質(zhì)阻力。馬書(shū)章等[11]研究了促溶劑對(duì)甲基睪丸素脫氫的影響,發(fā)現(xiàn)選用 4%甲醇和 0.01%吐溫 80作為混合促溶劑時(shí),轉(zhuǎn)化率提高至 81%。Fernandes等[12]考察了表面活性劑對(duì)轉(zhuǎn)化體系的影響,發(fā)現(xiàn)一方面表面活性劑能在有機(jī)溶劑和水兩相界面形成微乳,降低傳質(zhì)阻力,另一方面水相中膠束的形成降低了甾類產(chǎn)物在有機(jī)溶劑和水兩相的分配系數(shù),有利于反應(yīng)的進(jìn)行,但不利于產(chǎn)物的回收。因此,常通過(guò)加入表面活性劑或促溶劑改變?nèi)芤盒再|(zhì)以增加底物溶解度,加快傳質(zhì)。

2.3.2 底物微粉化 底物溶解度與物料的比表面積有關(guān)。采用微粉化技術(shù)減小粒徑,使之達(dá)到微米級(jí)甚至納米級(jí),可有效提高難溶性底物溶解度,增加底物與菌體接觸的表面積,提高轉(zhuǎn)化率,增加底物投料濃度。如醋酸可的松的投料,工業(yè)上常用氣流粉碎底物,直接加料,然后加入乙醇助溶,投料濃度可提高至 7%,底物轉(zhuǎn)化率達(dá) 90%以上[13]。用赫曲霉進(jìn)行黃體酮 11α羥化時(shí),投入微粉化的底物 (90%顆粒小于 10μm),則底物濃度可提高到 1.5%～4%[14]。陽(yáng)葵等[15]研究底物的分散和溶解對(duì)甾體微生物酶反應(yīng)的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)超聲處理與分散劑配合使用效果較佳,認(rèn)為超聲處理使底物高度細(xì)化,而分散劑的加入不僅可使底物分散,而且能消除因超聲造成的體系不穩(wěn)定性。

2.4 解除底 (產(chǎn))物抑制作用

高濃度的底物或產(chǎn)物都會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生一定的抑制作用。龔萬(wàn)本等[16]考察了簡(jiǎn)單節(jié)桿菌催化 6α-甲基醋酸可的松C1,2脫氫動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)較高的底物濃度和產(chǎn)物濃度均會(huì)對(duì)脫氫反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。A rinbasarova等[17]研究了 Arthrobacter globiformis 193對(duì) 6α-甲基可的松 1-烯-脫氫酶的生化反應(yīng)特征,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)遵循多底物抑制模型,并且主要抑制呼吸鏈。為減少該抑制作用,可考慮采用新型的脫氫反應(yīng)體系,以降低產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的抑制作用。

2.5 環(huán)糊精

環(huán)糊精是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱,通常含有6～12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精可用于促進(jìn)底物溶解和增加脫氫酶的活性,在甾類的生物脫氫方面具有很好的研究?jī)r(jià)值。環(huán)糊精對(duì)甾體脫氫的影響有較多報(bào)道。

申雁冰等[18]研究了羥丙基 -β-環(huán)糊精 (HP-β-CD)對(duì)植物甾醇側(cè)鏈生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響,結(jié)果表明添加 HP-β-CD構(gòu)建成一種新的超分子介質(zhì)體系可以提高分歧桿菌降解植物甾醇生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的反應(yīng)速率和摩爾轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化 168 h時(shí)植物甾醇摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到 89.9%,較對(duì)照實(shí)驗(yàn)提高了 3.1倍。這可能由于β-環(huán)糊精能與甾體化合物形成鑲嵌復(fù)合物,增大溶解度,加速底物向細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程,從而顯著加速微生物轉(zhuǎn)化[19]。Wang等[20]以簡(jiǎn)單節(jié)桿菌生物脫氫可的松醋酸酯為模型,評(píng)估了 HP-β-CD對(duì)甾體Δ1-脫氫的影響,結(jié)果顯示,HP-β-CD對(duì)Δ1-脫氫酶具有促進(jìn)作用,不但能提高反應(yīng)速率,而且能提升最終的底物轉(zhuǎn)化率,因?yàn)?HP-β-CD具有良好的生物相容性,同時(shí)還能夠提高底物和產(chǎn)物的溶解度,更能緩解產(chǎn)物的抑制作用。

2.6 其它

提高轉(zhuǎn)化率其中重要的途徑之一是對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。常用的方法有正交實(shí)驗(yàn)法、響應(yīng)面法和遺傳算法。王普等[10]利用正交優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),比原先的最佳培養(yǎng)基所得酶活提高了 8%。另外,加入某些微量金屬離子亦可以增加轉(zhuǎn)化率 ,如 Mg2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Ca2+。Adham等[21]發(fā)現(xiàn) K+、Na+、Ca2+、Mg2+以適宜的濃度能夠促進(jìn) 尼松龍的生產(chǎn),熒光假單胞菌內(nèi)的Δ1-脫氫酶可被 EDTA明顯加強(qiáng),該培養(yǎng)基的優(yōu)化不僅使波尼松龍產(chǎn)量提升 1.3倍,而且副產(chǎn)物羥基 尼松龍的產(chǎn)量下降了 50%,這可能是螯合試劑 (EDTA)對(duì)其中的強(qiáng)化酶有抑制效果,該研究還發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鈉和甲苯酸納能夠誘導(dǎo)Δ1-脫氫酶的產(chǎn)生。由此可見(jiàn),不同的金屬陽(yáng)離子和有機(jī)陰離子對(duì)脫氫酶的活力也有一定的影響。適宜的離子對(duì)脫氫反應(yīng)有促進(jìn)作用。

3 新型脫氫反應(yīng)體系

3.1 微乳體系

微乳一般由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)?shù)谋壤旌?為熱力學(xué)穩(wěn)定的透明分散體系。楊玉芬等[22]采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌 Arthrobacter simplex UR016菌株,構(gòu)建Tween-80/乙醇 /食油 /水微乳體系,通過(guò)改善底物傳質(zhì),提高11-羥基甲羥孕酮 C1,2位的脫氫轉(zhuǎn)化率,Tween-80在體系中作為表面活性劑,為底物在水相和油相之間傳遞充當(dāng)了媒介,提高了脫氫反應(yīng)速率。Smolders等[5]利用微乳體系進(jìn)行高濃度的 16-甲基-萊氏化合物 S-21-醋酸酯的 C1,2脫氫反應(yīng),反應(yīng) 14～16 h后轉(zhuǎn)化率可達(dá) 98%。Goetschel等[23]構(gòu)建了脂質(zhì)體反應(yīng)介質(zhì),利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌對(duì)氫化可的松進(jìn)行脫氫反應(yīng)。由于高疏水性的甾類底物被包裹在脂質(zhì)體中,所以底物和產(chǎn)物具有較好的傳質(zhì),而脂質(zhì)體的主要成分為磷脂,所以它又能與細(xì)胞具有較好的接觸,促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。

3.2 雙水相體系

雙水相體系是指兩種不同的高聚物或一種高聚物和一種無(wú)機(jī)鹽在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙舛纬傻幕ゲ幌嗳莸膬梢合囿w系,具有生物相容性高、反應(yīng)條件溫和以及實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)-產(chǎn)物分離耦合等優(yōu)點(diǎn)。孫新宇等[24]利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌在 PEG/Dextran雙水相體系中對(duì) 6-甲基氫化可的松進(jìn)行脫氫,研究得到最佳轉(zhuǎn)化體系組成和配比為 16%PEG 20000/4%Dextran 40000時(shí),甲基氫化可的松的轉(zhuǎn)化率可達(dá)95.72%。

3.3 有機(jī)溶劑-水兩相體系

有機(jī)溶劑的加入主要是增加底物和產(chǎn)物的溶解度,并且可以儲(chǔ)存底物和產(chǎn)物,對(duì)水相進(jìn)行萃取,解除底 (產(chǎn))物對(duì)脫氫酶的抑制。Fernandes等[12]研究了簡(jiǎn)單節(jié)桿菌游離細(xì)胞在有機(jī)溶劑 /水兩相體系中生物轉(zhuǎn)化 6-α-甲基氫化可的松-21醋酸酯的反應(yīng),綜合考慮了甾體的溶解度和生物相容性,發(fā)現(xiàn)正辛醇為最佳溶劑。Jiradej等[25]考察了固定化細(xì)胞對(duì)反應(yīng)的影響,觀察到海藻酸鈣對(duì)疏水性底物具有強(qiáng)烈的傳質(zhì)阻力,因此轉(zhuǎn)化率都較相應(yīng)的游離細(xì)胞催化脫氫的結(jié)果低。有機(jī)溶劑的存在,引起微生物細(xì)胞中的輔酶再生系統(tǒng)會(huì)失活,Bie等[26]構(gòu)建的 30%四氟化碳-70%磷酸鉀緩沖液兩相體系,加入維生素 K作為外源電子受體,簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的脫氫轉(zhuǎn)化率達(dá) 95%。不可否認(rèn),有機(jī)溶劑對(duì)微生物細(xì)胞存在不可忽略的毒副作用。通過(guò)加入外源電子受體,構(gòu)建人工電子傳遞鏈,可使氧化還原反應(yīng)得以正常進(jìn)行。

3.4 含離子液體體系

離子液體具有接近為零的蒸汽壓、熱穩(wěn)定性、可通過(guò)設(shè)計(jì)陰陽(yáng)離子改變本身性質(zhì)等特性,已受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[27]。Xie等[28]對(duì)離子液體對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌生長(zhǎng)毒性進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含三氟陰離子的離子液體對(duì)菌體毒性最大,離子液體 1-乙基-3-甲基咪唑 L-乳酸鹽 ([Emim][lactate])、1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸鹽 ([Bmim][lactate])在低濃度(小于 2.5×10-3mol/L)下對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌生長(zhǎng)毒性較小,可作為整細(xì)胞催化甾類藥物脫氫的理想溶劑。He等[29]將離子液體以共溶劑形式添加到 Tris-HCl緩沖液 /甲苯兩相體系中,研究該體系對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化 11β-羥基甲孕酮脫氫的影響,發(fā)現(xiàn)相體積比為 5∶2,添加 1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸鹽 20 g/L,轉(zhuǎn)化 16 h后,轉(zhuǎn)化率達(dá) 80.9%,較未添加離子液體的體系提高了 20.9%。M ina等[30]以離子液體 1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸鹽為輔助溶劑,加入甲酸鹽脫氫酶與 3α-羥基甾體脫氫酶形成偶聯(lián)酶系統(tǒng),重現(xiàn)輔酶再生,使產(chǎn)率提高了近 2倍。

4 結(jié) 語(yǔ)

脫氫反應(yīng)是甾體化合物生物轉(zhuǎn)化合成中重要的反應(yīng)之一,脫氫產(chǎn)物如去氫甲基睪丸素、醋酸潑尼松等都是廣泛應(yīng)用的藥物。目前甾類脫氫轉(zhuǎn)化主要難點(diǎn)是如何提高底物的溶解度,解除底物、產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的抑制作用等,上述甾類藥物生物脫氫新技術(shù)的應(yīng)用,在增強(qiáng)底物溶解度,強(qiáng)化反應(yīng)過(guò)程的傳質(zhì),提高轉(zhuǎn)化率方面取得了較好的效果,特別是近年來(lái)新興的含離子液體的反應(yīng)體系,以及加有環(huán)糊精的甾類生物脫氫體系,具有較好的應(yīng)用前景。甾體脫氫酶序列的測(cè)定以及基因重組技術(shù)的應(yīng)用,有望獲得高產(chǎn)酶菌株。相信隨著研究的深入和更多的提高甾類脫氫轉(zhuǎn)化率新技術(shù)、新方法的應(yīng)用,甾體藥物的生物脫氫技術(shù)將會(huì)有更大的發(fā)展。

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Research progress in biodehydrogenation technique of steroid medicine

ZHENG Shu-xiang1,WANG Rong-zhu2,X IE Song-lin2,HE Jun-yao2,WANG Pu2
(1.Jianxing School,2.School of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

TQ463

A

1005-1678(2011)03-0251-04

2010-03-01

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目;浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.Y407289)

鄭書(shū)香,女,本科生,生物制藥專業(yè),E-mail:shuxiangzheng@gmail.com;王 普,女,通信作者,教授,E-mail:wangpu@zjut.edu.cn。