徐美娟，張顯，饒志明，楊娟，竇文芳，金堅，許正宏

1 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學醫(yī)藥學院，無錫 214122

L-精氨酸 (L-arginine，簡稱L-Arg) 是一種含胍基的堿性氨基酸，是人體和動物體內的半必需氨基酸，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝物，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中用途廣泛，具有獨特的生理和藥理作用；L-精氨酸還是配制營養(yǎng)或特殊治療用途藥物的重要原料[1]，發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸的研發(fā)是目前國內外研究的熱點[1-2]。細菌中從 L-谷氨酸合成精氨酸有3條途徑：線性途徑、循環(huán)途徑及新發(fā)現(xiàn)的利用氨甲?；D移酶進行精氨酸生物合成的新途徑[3-5]，如圖1所示。

鈍齒棒桿菌 Corynebacterium crenatum、谷氨酸棒桿菌、嗜熱鏈球菌、假單胞菌等利用經(jīng)濟循環(huán)途徑合成精氨酸，乙酰鳥氨酸轉氨酶(N-Acetylornithine aminotransferase，EC 2.6.1.11) (ACOAT) 在合成 L-精氨酸循環(huán)途徑中催化第 4個酶促反應，即催化底物 N-乙酰谷氨酸半醛合成 N-乙酰鳥氨酸，需要 5-磷酸吡哆醛作為輔酶。反應方程式如下：

隨著原料氨基酸的需求量日益增長，用傳統(tǒng)誘變育種手段提高L-精氨酸產(chǎn)量已不能滿足日益增長的需要，開始利用DNA重組技術及代謝工程手段來調控L-精氨酸相關代謝途徑，以達到提高產(chǎn)量的目的。C. crenatum SYPA 5-5是本實驗室篩選并經(jīng)過多步傳統(tǒng)誘變得到的一株鈍齒狀、無芽孢的革蘭氏陽性高產(chǎn) L-精氨酸突變菌株[6-7]。本課題組對 C. crenatum的谷氨酸合成精氨酸的代謝途徑相關酶進行了功能分析及其酶學性質的研究，為進一步對精氨酸合成的發(fā)酵過程優(yōu)化提供理論指導意義，在此基礎上進行加強表達，并對系列重組菌進行發(fā)酵分析。本研究室克隆了來自于高產(chǎn)精氨酸菌株 C. crenatum SYPA 5-5中的乙酰鳥氨酸轉氨酶 (ACOAT) 編碼基因argD，首先在大腸桿菌中高效表達，利用鎳柱親和層析對表達有活性的重組ACOAT進行純化，對酶學性質進行初步研究；并構建了重組鈍齒棒桿菌/ pJCtac-CcargD (CCD)，在C. crenatum中加強轉氨酶的表達，在重組鈍齒棒桿菌CCD進行酶活分析的基礎上進一步對其發(fā)酵產(chǎn)精氨酸進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

實驗所用菌株及質粒見表1。

1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

大腸桿菌：LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37 ℃，旋轉式搖床轉速160 r/min，氨芐青霉素濃度為100 μg/mL，卡那霉素濃度為50 μg/mL篩選轉化子，IPTG誘導終濃度為0.5~1 mmol /L。

圖1 細菌L-精氨酸生物合成途徑Fig. 1 The arginine biosynthesis pathway in bacteria.

表1 本實驗中所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

鈍齒棒桿菌：LBG培養(yǎng)基 (LB+0.5%葡萄糖)，培養(yǎng)溫度30 ℃，往復式搖床轉速160 r/min，發(fā)酵96 h，轉化子選用卡那霉素濃度為30 μg/mL篩選。

斜面培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 10。pH 7.0、115 ℃滅菌15 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30，玉米漿20，(NH4)2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，尿素1.5。pH 7.0~7.2、121 ℃滅菌20 min，裝液量30 mL/ 250 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖150 (分消)，玉米漿40，(NH4)2SO420，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，生物素8×10?5，L-組氨酸5×10?4，CaCO330。pH 7.0~7.2、121 ℃滅菌10 min，裝液量25 mL/250 mL[9]。

1.3 主要試劑及儀器

質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司；工具酶、IPTG購自TaKaRa公司；咪唑和抗生素購自上海Sangon公司；L-精氨酸琥珀酸購自 Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 (American Promega Corporation)、廣范圍蛋白質分子量標準購自 Fermentas公司；PCR引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)試劑純。基因擴增儀 (BioRad公司)，電擊儀 (Eppendorf)，BIOTECH-5BG 5 L發(fā)酵罐 (上海保興)。

1.4 方法

1.4.1 argD基因的克隆

由于C. crenatum的遺傳背景尚不清楚，其與谷氨酸棒桿菌同源性高，因此根據(jù) NCBI中谷氨酸棒

提取C. crenatum SYPA 5-5染色體為模板，PCR擴增條件為：94 ℃，5 min預變性；94 ℃ 50 s，58 ℃1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s ，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pMD18-T載體連接，轉化E. coli JM109，挑取陽性轉化子。提取質粒酶切鑒定，并將重組質粒命名為T-CcargD，測序。

1.4.2 重組大腸桿菌表達載體的構建及乙酰鳥氨酸轉氨酶 (ACOAT) 編碼基因的誘導表達

將T-CcargD進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，膠回收argD片段，與經(jīng)相同酶切線性化的pET-28a(+) 載體連接，轉化E. coli BL21 (DE3)，篩選陽性轉化子。經(jīng)酶切驗證，挑選陽性轉化子接種至含卡那霉素(終濃度為50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%接種量轉接，至OD600約0.6~0.8時加入IPTG進行 16 ℃過夜誘導表達[10]。

1.4.3 重組大腸桿菌-鈍齒棒桿菌穿梭表達載體的構建

將T-CcargD進行SalⅠ、BamHⅠ雙酶切，膠回收argD片段，與相同酶切的線性化載體pJC-tac連接，轉化大腸桿菌E. coli JM109，篩選陽性轉化子，經(jīng)質粒驗證后備用。

1.4.4 SDS-PAGE

采用5%的濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮蘭R-250染色。桿菌C. glutamicum ATCC 13032的全基因組核苷酸序列中1 176 bp argD基因序列 (GenBank Accession No. BA000036.3)，設計乙酰鳥氨酸轉氨酶編碼基因的引物如表2所示。

表2 本實驗中所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.4.5 乙酰鳥氨酸轉氨酶的純化

誘導表達的菌液于10 000 r/min、4 ℃離心收集菌體，進行超聲波破碎細胞，PBS緩沖液 (pH 7.4)懸浮菌體，0.45 μm濾膜過濾后上柱，經(jīng) Ni-NTA純化[10]。

1.4.6 乙酰鳥氨酸轉氨酶活力的測定[11-14]

酶反應體系：0.5 mL反應液含100 mmol磷酸鉀緩沖液 (pH 9.5) (加入不同濃度的 K2HPO4、KH2PO4或由KOH調節(jié)至目標pH值)，10 mmol N-乙酰-L-鳥氨酸，5 mmol α-酮戊二酸鉀，0.5 mmol 5-磷酸吡哆醛及適量酶液。37 ℃水浴15 min后加入0.2 mL反應終止液 (10 mol/L HCl)，終止反應后沸水浴45 min，冷卻至室溫后離心，上清加入1 mL 3.6 mmol的醋酸鈉和0.2 mL 10 mmol的鄰氨基苯甲醛，室溫顯色15 min，測定440 nm下的吸光值。產(chǎn)物5-吡咯羧酸440 nm的摩爾吸光系數(shù)為1.9×103L/(mol·cm)。本實驗利用精氨酸合成途徑中的逆向反應，采用N-乙酰-L-鳥氨酸和α-酮戊二酸鉀為底物，5-磷酸吡哆醛為輔酶，有明顯的黃色反應則為有酶活。其原理是利用鄰氨基苯甲醛和酶促反應產(chǎn)物自身環(huán)化脫乙?；?5-吡咯羧酸產(chǎn)生黃色反應，440 nm下測定光吸收值。

一個ACOAT活力單位 (U) 定義為在上述反應條件下，每分鐘轉化α-酮戊二酸鉀生成1 μmol產(chǎn)物環(huán)化后生成5-吡咯羧酸所需的酶量。

1.4.7 蛋白質含量測定

酶液蛋白含量采用Bradford法[16]測定，以BSA為標準蛋白。

1.4.8 乙酰鳥氨酸轉氨酶的酶學性質的初步研究

最適pH及pH穩(wěn)定性：配制pH 4.0~12.0的反應緩沖液，30 ℃下將酶分別與不同pH的反應液混合，測定ACOAT在不同pH體系中酶活，觀察pH對酶促反應的影響。再將一定量的酶液加入到以上不同pH的反應緩沖液中，30 ℃保溫1 h，測定剩余酶活，觀察ACOAT在不同pH條件下的穩(wěn)定性。

最適溫度及熱穩(wěn)定性：采用pH 7.0反應液，分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、45 ℃，55 ℃、65 ℃、80 ℃溫度下測定酶活，研究溫度對酶的影響。將酶液置于以上不同溫度下保溫1~5 h，測定剩余酶活，觀察ACOAT在不同溫度下的穩(wěn)定性。

不同金屬離子、EDTA及精氨酸和鳥氨酸的添加對酶活的影響：在反應液中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Li+、Ni2+、Mn2+、Zn2+、Na+以及EDTA、L-鳥氨酸、L-精氨酸，30 ℃下測定ACOAT酶活，以不另加任何物質的反應液作為對照，研究不同金屬離子對酶促反應的影響[17]。

1.4.9 重組鈍齒棒桿菌的獲得

采用電擊轉化法[18]將重組質粒轉化鈍齒棒桿菌，涂布含有30 μg/mL卡那霉素的固體LBG平板于30 ℃培養(yǎng)36 h，挑取轉化子驗證后于斜面保藏。

1.4.10 鈍齒棒桿菌的發(fā)酵

從斜面挑取一環(huán)菌體接種種子培養(yǎng)基，30 ℃于往復搖床培養(yǎng)15~16 h。5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐中裝液量3 L，接種量5%，通風量3 L/min，流加氨水控制pH 7.0，攪拌轉速為600 r/min，30 ℃發(fā)酵96 h。

1.4.11 菌體生長的測定

發(fā)酵液用0.25 mol/L的鹽酸稀釋至適當倍數(shù)，測定 562 nm處的光密度，按照 1 OD=0.375 g/L DCW，換算為菌體干重 (文中以DCW表示)[7,17]。

1.4.12 發(fā)酵液中還原糖的測定

采用SBA-40B生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度[19]。

1.4.13 氨基酸含量的測定

采用坂口試劑法測定精氨酸[20-21]及氨基酸自動分析儀測定發(fā)酵液中氨基酸含量。

2 結果

2.1 鈍齒棒桿菌argD基因的克隆及分析

以C. crenatum SYPA5-5基因組DNA為模板，引物P1、P2進行PCR擴增，得到大小1 176 bp、編碼390個氨基酸的基因片段，連接至pMD18-T載體測序，比對結果表明C. crenatum SYPA argD基因與C. glutamicum ATCC 13032 argD同源性為99.32%，相差8個堿基，4個氨基酸。C. crenatum SYPA 5-5基因 argD核苷酸序列已提交 GenBank數(shù)據(jù)庫(Accession No. HQ602711)。

2.2 重組大腸桿菌BL21 (pET-28a-argD) 的構建

將 T-CcargD用 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收argD片段后，與線性化pET-28a(+) 連接后轉化，陽性轉化子提取質粒經(jīng) EcoRⅠ、XhoⅠ酶切驗證，釋放5 369 bp和約1 176 bp大小的片段，分別對應pET-28a(+) 和argD的大小，結果表明質粒pET-28a-CcargD構建成功。

2.3 CcargD基因在E. coli BL21 (DE3) 中表達與重組蛋白ACOAT的純化

重組菌pET-28a(+)-CcargD/BL21 (DE3)，經(jīng)誘導表達菌液經(jīng)超聲破碎取上清SDS-PAGE分析，檢測到分子量約為42 kDa的特異性條帶，如圖2所示。上清液測得酶活為65.7 U/g，約為對照菌株BL21粗酶液酶活的6倍，說明argD基因在大腸桿菌中表達，乙酰鳥氨酸轉氨酶具生物學活性。采用 Ni-NTA親和層析，純化后ACOAT酶液比酶活為108.2 U/g，回收率達77.8%，結果見表3。

2.4 乙酰鳥氨酸轉氨酶的酶學性質

2.4.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

由圖3可知重組酶的最適反應pH為8.0，但在pH 6.0~9.0范圍內酶活均處于較高的水平，在酸性和強堿的條件下，酶活損失嚴重。將 ACOAT在pH 6.0~10.0處理1~5 h后測定酶活性，在pH 7.0、8.0、9.0、10.0時保溫1 h后的酶活力均能保持85%以上的酶活力，說明 ACOAT在弱堿性環(huán)境下相對穩(wěn)定，而重組酶保存在pH值為8.0的緩沖液條件下穩(wěn)定性最佳 (圖4)。

圖2 重組菌全細胞蛋白及ACOAT純化后SDS-PAGE電泳分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cells and ACOAT purification. 1: supernatant of E. coli BL21 with plasmid pET-28a(+); 2,3: supernatant of E. coli BL21 with recombinant plasmid pET-28a(+)-CcargD; 4: protein markers (kDa); 5: purified ACOAT.

2.4.2 最適反應溫度及熱穩(wěn)定性

如圖5所示，在4 ℃~80 ℃范圍內進行酶促反應，最適反應溫度為30 ℃，而已報道的腸桿菌屬的乙酰鳥氨酸轉氨酶的最適反應溫度為 37 ℃[9]。在20 ℃、25 ℃、37 ℃酶活力相似約為在30 ℃條件下的97%；由圖6可知，37 ℃保溫5 h后有74%活力，55 ℃保溫5 h后仍留有69%活力，表明該酶熱穩(wěn)定性較好。ACOAT在4 ℃~40 ℃較穩(wěn)定，保溫1 h后相對酶活仍在80%以上，隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達65 ℃時ACOAT幾乎完全失活，且檢測不到酶活，說明酶已完全失活。

表3 重組酶乙酰鳥氨酸轉氨酶純化表Table 3 Purification of recombinant ACOAT

圖3 pH對轉氨酶活力的影響Fig. 3 Effect of pH on enzymatic transamination.

圖4 乙酰鳥氨酸轉氨酶的pH穩(wěn)定性Fig. 4 pH stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

圖5 溫度對轉氨酶活力的影響Fig. 5 Effect of temperature on enzymatic transamination.

圖6 乙酰鳥氨酸轉氨酶的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

2.4.3 金屬離子及EDTA對ACOAT酶促反應的影響

金屬離子可作為酶促反應的輔助因子，在酶促反應中常添加一些金屬離子。在 ACOAT酶促反應添加金屬離子以及 EDTA，以不加離子的反應液作為對照設其酶活為100%，離子對ACOAT酶活的影響結果見表 4。Ni2+對轉氨酶的酶活力有明顯促進作用；Mn2+、Cu2+、Fe3+等加入后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，酶活較低，此時酶蛋白大多已失活；Na+、Li+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+及EDTA對酶促反應影響較小；Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+均具有一定抑制作用。

2.4.4 精氨酸、鳥氨酸對ACOAT酶促反應的影響

反應體系中添加終濃度為1 mmol/L的L-精氨酸以及L-鳥氨酸 (該酶在以L-精氨酸和L-鳥氨酸為底物時沒有轉氨活性)，測定代謝途徑相關氨基酸對ACOAT酶活影響，分別測得酶活為 104.9 U/g和118.9 U/g，說明 L-鳥氨酸的添加對鈍齒棒桿菌ACOAT催化底物N-乙酰鳥氨酸與α-酮戊二酸生成N-乙酰谷氨酸半醛的轉氨反應起促進作用，酶活提高 9.89%；L-精氨酸的添加對其酶促反應幾乎沒有影響，說明此酶不受終產(chǎn)物反饋抑制。

2.5 重組鈍齒棒桿菌C. crenatum (pJCtac-CcargD)的構建

構建重組質粒pJCtac-CcargD同上文，經(jīng)SalⅠ、BamHⅠ雙酶切，釋放約6 400 bp和1 100 bp大小的片段，分別對應于pJCtac和argD的大小，證明重組質粒構建成功。電擊轉化C. crenatum SYPA，在含卡那霉素的 LBG平板上篩選陽性轉化子 C. crenatum (pJCtac-CcargD)。

2.6 重組鈍齒棒桿菌的獲得及其與 C. crenatum SYPA中ACOAT酶活力比較

研究發(fā)現(xiàn) IPTG的添加對菌體生長具有一定的毒性，由于tac啟動子在鈍齒棒桿菌中未經(jīng)IPTG誘導即有本底表達，因此以下重組菌的發(fā)酵中選擇不添加IPTG。挑選一組C. crenatum (pJCtac-CcargD)轉化子和出發(fā)菌株C. crenatum SYPA接種于LBG培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后轉接于種子培養(yǎng)基18 h后收集菌體，經(jīng)超聲波破碎，測定粗酶液中 ACOAT酶活，選擇其中3組數(shù)據(jù)如表5所示?？梢钥闯觯亟M菌粗酶液的轉氨酶活力顯著提高，其中以 3號轉化子提高最多，提高了 84.4%，證明了重組菌 ACOAT表達量加強。

2.7 重組菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 與 C. crenatum SYPA 5-5發(fā)酵產(chǎn)精氨酸比較

挑取酶活提高較多的 8個重組菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 和出發(fā)菌株C. crenatum SYPA同時搖瓶發(fā)酵，將8個轉化子分別命名為CCD (1~8)，每個轉化子取 3個平行，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸比較。將產(chǎn)量最高的轉化子命名為 CCD1和出發(fā)菌株 C. crenatum SYPA 5-5進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，每隔8 h取樣對OD、殘?zhí)羌爱a(chǎn)酸進行跟蹤測定，多次發(fā)酵結果表明轉化子CCD1產(chǎn)酸穩(wěn)定，取3次發(fā)酵數(shù)據(jù)繪制圖 7，由圖可知 CCD1較出發(fā)菌株 C. crenatum SYPA 5-5在生長前期稍慢，對數(shù)生長期后兩者生長狀態(tài)已基本趨于一致；40 h到96 h為菌體生長的穩(wěn)定期也是精氨酸積累的關鍵時期，此時重組菌CCD1發(fā)酵產(chǎn)酸優(yōu)勢趨于明顯，精氨酸生成率明顯提高，至發(fā)酵結束時產(chǎn)量達到最高達39.7 g/L，較出發(fā)菌株C. crenatum SYPA產(chǎn)酸34.6 g/L提高了14.7%。由耗糖曲線可以看出重組菌的耗糖能力從16 h開始便強于對照出發(fā)菌株，到發(fā)酵96 h時葡萄糖殘留量都為 0。結果表明加強精氨酸合成代謝途徑中的轉氨酶表達可以增強精氨酸合成的代謝流從而對增強L-精氨酸的合成途徑有一定的加強作用，但提高幅度不大。由圖7 (E) 可知發(fā)酵溶氧曲線，argD的增強表達對菌株的溶氧水平的影響較顯著，重組菌CCD1與對照菌株 SYPA相比從發(fā)酵起始溶氧曲線始終保持較低水平，說明重組菌發(fā)酵罐內氧氣利用較多，說明菌體中argD的加強表達提高菌體氧利用率顯著。

表4 金屬離子及EDTA對ACOAT酶活性的影響Table 4 Effect of metal ion and EDTA on the activity of ACOAT

表5 重組菌與原始C. crenatum SYPA ACOAT酶活力分析比較Table 5 Comparison of ACOAT enzyme activities in the CCD (pJCtac-CcargD/C. crenatum) and C. crenatum SYPA

圖7 重組菌CCD1 (pJCtac-CcargD/C. crenatum) 與原始菌株的發(fā)酵曲線Fig. 7 Comparison of L-arginine production between the CCD1 (pJCtac-CcargD/C.crenatum) and C. crenatum SYPA. (A) Cell concentration. (B) Glucose concentration. (C) L-arginine concentration. (D) L-arginine production rate. (E) The dissolved oxygen (DO) changing patterns.

3 討論

本文首先研究了精氨酸合成代謝途徑中N-乙酰鳥氨酸轉氨酶的酶學性質，C. crenatum ACOAT在弱堿性酶活相對穩(wěn)定，而來自于E. coli和Klebsiella aerogenes的ACOAT的酶學性質最適溫度為37 ℃，最適 pH為 6.5和 7.0[13,22-23]，本課題組還分析了此代謝途徑中其他酶的性質，發(fā)現(xiàn)argC-argH編碼的7個酶最適pH都在6.5~8.0之間，從酶促反應的角度解釋了精氨酸發(fā)酵過程需要維持pH 7.0~7.5。還發(fā)現(xiàn)了Ni2+的促進作用和 Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+的抑制作用，這為深入研究其蛋白結構和作用機理，以便更清晰了解C. crenatum SYPA精氨酸合成途徑奠定了基礎，同時為改良發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基的優(yōu)化進一步提高產(chǎn)酸提供了可靠理論依據(jù)；本研究還發(fā)現(xiàn)了鳥氨酸的添加對 ACOAT的酶活具有一定的激活作用，但其作用機理將在對ACOAT進行蛋白結構分析的基礎上進行分析，相關研究正在進行。

另外，利用代謝工程提高L-精氨酸產(chǎn)量最重要的策略之一是提高關鍵酶酶量，郝寧等在加強了鈍齒棒桿菌中合成精氨酸關鍵酶基因N-乙酰谷氨酸激酶表達后其產(chǎn)量提高了25%[24]。本課題組同樣也對C. crenatum SYPA 5-5的精氨酸合成關鍵酶基因argB進行了加強表達研究，重組菌CCB產(chǎn)酸量提高較明顯，提高幅度為 23.4%，與郝寧等的研究結果相似。本文通過增加轉氨酶編碼基因表達量，較出發(fā)菌株ACOAT酶活提高了84%；發(fā)現(xiàn)ACOAT的增強表達對菌株溶氧水平影響顯著，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)溶氧在精氨酸的合成中起重要作用，高溶氧條件下精氨酸的產(chǎn)量明顯高于低溶氧條件下的產(chǎn)酸量[7]，重組菌 CCD1在發(fā)酵精氨酸過程中氧利用率明顯高于對照菌株，從實驗結果來看，重組菌精氨酸產(chǎn)量提高一方面是由于 argD的過量表達增強了精氨酸合成代謝流，另一方面是由于菌體自身氧利用率提高，從而使得重組菌精氨酸的產(chǎn)量提高了14.7%。本研究為構建高產(chǎn)精氨酸重組基因工程菌提供理論依據(jù)，具有一定的指導意義。另外本文證明了加強合成代謝途徑中某一種酶 (關鍵酶/非關鍵酶) 的表達既可以增強產(chǎn)物合成代謝流量，也可能改變菌體的某些其他發(fā)酵性能，這為氨基酸代謝研究提供了一定的實踐參考。

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