劉栩晗,李國(guó)生,黃 瀾,朱 華,劉亞莉,馬春梅

(1.大連市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,遼寧 大連 116003;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,遼寧 大連 116011;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病理科,北京 100021)

黃連素對(duì) 2型糖尿病中國(guó)地鼠肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)表達(dá)的影響

劉栩晗1,李國(guó)生2,黃 瀾3,朱 華3,劉亞莉3,馬春梅3

(1.大連市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,遼寧 大連 116003;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,遼寧 大連 116011;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病理科,北京 100021)

[目的]研究黃連素對(duì)2型糖尿病中國(guó)地鼠肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的影響,探討黃連素治療脂誘性肝胰島素抵抗的分子機(jī)制。[方法]以高脂飲食及結(jié)合小劑量鏈脲菌素的方法建立胰島素抵抗和 2型糖尿病中國(guó)地鼠模型。成模后隨機(jī)分成正常對(duì)照組、胰島素抵抗組、2型糖尿病組和 2型糖尿病黃連素治療組,治療 9周。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組地鼠肝臟 SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因的表達(dá)。[結(jié)果]PCR結(jié)果顯示模型地鼠脂肪變的肝臟中SREBPs基因、SREBPs切割激活蛋白(SCAP)基因、蛋白酶 S1P和S2P基因和 SREBPs靶基因的表達(dá)增加,胰島素誘導(dǎo)基因(Insigs)的表達(dá)降低。黃連素有效地改善胰島素抵抗,同時(shí),逆轉(zhuǎn)了SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的改變。[結(jié)論]SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)參與黃連素治療 2型糖尿病地鼠脂誘性肝胰島素抵抗。

黃連素;2型糖尿病;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白;胰島素抵抗;中國(guó)地鼠;肝臟

胰島素抵抗和胰島素分泌受損是 2型糖尿病的重要特征。依據(jù)藥物的作用機(jī)制,目前用于治療 2型糖尿病的藥物主要分為胰島素增敏性藥物和促胰島素分泌性藥物。黃連素是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥黃連的主要生物活性成分,具有胰島素增敏性藥物的作用特點(diǎn)及較小的毒副作用。糖尿病脂毒性理論提出：高脂飲食性肥胖發(fā)生 2型糖尿病的潛在機(jī)制是胰島素敏感組織異位脂沉積造成的脂誘性胰島素抵抗[1,2]。因此,脂誘性肝臟胰島素抵抗在肥胖相關(guān) 2型糖尿病形成中發(fā)揮重要作用。作者選擇具有糖尿病易感性和脂代謝類人性的中國(guó)地鼠[3]建立肥胖胰島素抵抗和2型糖尿病地鼠模型并研究黃連素對(duì)糖尿病地鼠肝臟 SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)表達(dá)的影響,探討黃連素治療肝臟脂誘性胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康中國(guó)地鼠,雌雄各半,60只,清潔級(jí),血糖(4.41±0.59)mmol/L,26周齡,體重 (124.0±10.5)g,購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,許可證號(hào)：SCXK(川)2004216。單籠飼養(yǎng),飼以標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料,自由攝食攝水,12 h光照周期。

1.2 主要藥品試劑及儀器

高脂飼料購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,配方為：1%膽固醇,0.02%牛膽酸鈉,10%豬油,10%蛋黃粉及 78.98%基礎(chǔ)飼料。鏈脲菌素(STZ)購(gòu)自 Sigma公司。應(yīng)用穩(wěn)豪 One-Touch血糖儀監(jiān)測(cè)血糖。鼠胰島素 ELISA試劑盒(美國(guó) Linco公司)購(gòu)自吉泰公司。血甘油三酯(TG)試劑盒、游離脂肪酸(FFAs)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒(Randox公司)均購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。日立 8060全自動(dòng)生化分析儀。RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit,德國(guó) Qiagen公司)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Omniscript Reverse Transcription Kit,德國(guó) Qiagen公司)購(gòu)自基因有限公司。HotStarTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa)購(gòu)自百靈克公司,Mg2+及緩沖液為 Taq酶自帶 。 RNase inhibitor、Oligo-dT(美國(guó) Promea公司)和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)試劑盒(iQ SYBR Green PCR Kit,美國(guó) Bio-rad公司)購(gòu)自東勝創(chuàng)新公司。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國(guó) Bio-rad公司)。紫外分光光度計(jì)(美國(guó) Amersham公司)。其余常用試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。黃連素原料藥,批號(hào)：200506065,購(gòu)自東北制藥總廠。

1.3 動(dòng)物模型制備、分組及治療

參照相關(guān)的造模方法[4-6]建立肥胖胰島素抵抗和 2型糖尿病地鼠模型并加以改進(jìn)。健康地鼠 60只,雌雄各半,隨機(jī)分為普食正常對(duì)照組和高脂飲食組,前者 10只,飼以普通飼料;后者 50只,飼以高脂飲食。飼養(yǎng) 4周后,高脂飲食喂養(yǎng)的地鼠自發(fā)形成肥胖性胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),將這些肥胖性胰島素抵抗地鼠隨機(jī)分成 2組,一組(40只地鼠)禁食 12 h后,按 40mg/kg(將 STZ用 0.1mmol/L,pH 4.2的無菌檸檬酸緩沖液配制成 1%STZ溶液,0.2 mm微孔過濾滅菌)的劑量間隔 2 d 2次腹腔注射 STZ,注射后繼續(xù)禁食 12 h建立 2型糖尿病模型。另一組(10只)及普食正常對(duì)照組(10只)注射等量的 0.1 mmol/L,pH 4.2的無菌檸檬酸緩沖液(注射方式和劑量相同)。處理后,各組地鼠繼續(xù)維持原飲食 2周。糖尿病和胰島素抵抗地鼠模型依據(jù)空腹血糖(糖尿病地鼠≥9 mmol/L)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)確定。造模結(jié)束時(shí)共得到 2型糖尿病地鼠 29只,選擇 20只,隨機(jī)分為 2型糖尿病組和黃連素治療的 2型糖尿病組,每組 10只,再將普通飼料組作為對(duì)照組,單純高脂飲食選擇 10只作為胰島素抵抗組,共4組。黃連素治療組按每日每只灌服 150 mg/kg黃連素(溶于羧甲基纖維素/PBS溶液)的劑量給藥 9周。對(duì)照組、胰島素抵抗組和 2型糖尿病組每日每只灌服相應(yīng)劑量的羧甲基纖維素/PBS溶液。治療期間對(duì)照組喂以普通飼料,其余各組繼續(xù)喂以高脂飼料。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組地鼠禁食 12 h,在禁食 9.5 h時(shí)稱重同時(shí)給藥,在給藥 2.5 h時(shí),乙醚麻醉,眼內(nèi)眥靜脈取血并處死,剖開腹腔,迅速取出肝臟、稱重、大部分肝臟液氮速凍并保存于 -80℃?zhèn)溆?少部分肝臟固定于 10%中性甲醛溶液。4℃3000 r/m in離心 20min分離血漿并保存于 -80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和糖耐量試驗(yàn)曲線下面積(AUC)

地鼠禁食 12 h后,給予葡萄糖 2 g/kg灌胃,乙醚麻醉后,在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn) (0、30、60、120和 180 min)眼內(nèi)眥靜脈取血測(cè)血糖。糖耐量曲線下面積 =1/2空腹測(cè)定值 +60 min測(cè)定值 +120 min測(cè)定值 +1/2 180m in測(cè)定值。

1.5 血生化檢測(cè)

血漿 FFAs、TC、LDL、HDL和 TG的濃度采用Randox公司試劑盒,應(yīng)用日立 8060全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用穩(wěn)豪血糖儀檢測(cè)血糖。應(yīng)用Linco公司鼠胰島素 ELISA試劑盒檢測(cè)血漿胰島素濃度。

1.6 組織形態(tài)學(xué)觀察

肝組織固定于 10%中性甲醛溶液,逐級(jí)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡觀察。

1.7 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取凍存肝組織 30 mg,按 RNeasy Mini Kit說明書提取總 RNA。RNA濃度及純度用紫外分光光度計(jì)(Amersham)進(jìn)行檢測(cè)。保證 260/280在 1.8～2.0之間,并用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1μg總 RNA,5×iScript Mix 4μL,iScript反轉(zhuǎn)錄酶 1μL,去核酸酶水 12μL,組成總體積 20 μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：25℃,5 m in;42℃,30 min;85℃,5min,冷卻至 4℃。

1.8 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)

在實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增之前對(duì)引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增以得到最適反應(yīng)條件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按 iQ SYBR Green Mix Kit說明書操作。建立15μL的反應(yīng)體系：50 ng總 RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,上游引物 0.5μL(6μmol/L),下游引物 0.5μL(6 μmol/L),2×iQ SYBRGreen Mix 7.5μL,去離子水5.5μL。使用 iQ Syber Green Supermix和 iCycler iQ Real-Time PCR Detection System擴(kuò)增。反應(yīng)條件是：95℃ 3min,95℃ 10 s,59℃45 s,45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增之后,做溶解曲線檢測(cè)產(chǎn)物的均一性,反應(yīng)從59℃開始,每個(gè)循環(huán) 10 s上升 0.5℃,共 80個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)均重復(fù) 3次。設(shè)立陰性對(duì)照。擴(kuò)增之前測(cè)定每對(duì)引物的擴(kuò)增效率,經(jīng)檢測(cè)所用引物的擴(kuò)增效率均接近于 1。樣本目標(biāo)基因相對(duì)含量的計(jì)算使用2(-Delta Delta C(T))方法[7]。β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列見表 1。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物列表Tab 1 Primers used for real-time RT-PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異使用 SPSS13.0進(jìn)行 t檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素組地鼠的代謝特征

各組地鼠的表型和代謝特征見表 2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與對(duì)照組相比,胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠的體重顯著增加(P＜0.05),表現(xiàn)肥胖,但兩者之間的體重差異無顯著性意義 (P＞0.05)。胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠的肝臟重量明顯增加(P＜0.05),肝重/體重的比值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),肝臟呈腫大狀態(tài)。與對(duì)照組相比,除了 HDL水平降低以外,胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠的血脂(包括 FFAs、TC、LDL和 TG)水平顯著升高(P＜0.05)。胰島素抵抗地鼠的血糖雖然有所升高,但未達(dá)到糖尿病的血糖標(biāo)準(zhǔn)。與對(duì)照地鼠和胰島素抵抗地鼠相比,2型糖尿病地鼠的血糖顯著升高(P＜0.05)。與對(duì)照組相比,胰島素抵抗地鼠表現(xiàn)明顯的高胰島素血癥,而 2型糖尿病地鼠的胰島素水平與對(duì)照組相似。與對(duì)照組相比,胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠 OGTT各指定點(diǎn)的血糖值增高(P＜0.05),血漿胰島素的水平異常,OGTT的糖曲線下面積增大(P＜0.05),胰島素抵抗地鼠的胰島素曲線下面積增大(P＜0.05),而 2型糖尿病地鼠的胰島素曲線下面積與對(duì)照組地鼠相近似(圖1)。胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠的胰島素敏感指數(shù)降低(P＜0.05),而胰島素抵抗指數(shù)升高(P＜0.05)(表 2)。經(jīng)過黃連素治療后,糖尿病地鼠的體重有所降低,但無顯著性意義(P＞0.05)。與糖尿病地鼠相比,黃連素治療組地鼠的肝臟重量明顯降低(P＜0.05)。除了 HDL水平增高以外,治療組地鼠的血脂(FFAs、TC、LDL和 TG)水平和血糖濃度顯著的降低(P＜0.05)。治療組地鼠血漿胰島素水平與對(duì)照組地鼠和模型組地鼠血漿胰島素水平相似。與糖尿病地鼠相比,治療組地鼠的 OGTT各指定點(diǎn)的血糖濃度減低(P＜0.05),各指定點(diǎn)血漿胰島素的分泌和分泌水平趨近于恢復(fù)正常。治療組地鼠糖曲線下面積減少(P＜0.05),胰島素曲線下面積與模型組相比無差異(P＞0.05)(圖 1)。治療組地鼠胰島素敏感指數(shù)增大而胰島素抵抗指數(shù)減小(P＜0.05)(表 2)。

表 2 對(duì)照組、胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素治療組地鼠的代謝表型特征Tab 2 Basalmetabolic characterization of control,insulin-resistant,diabetic and berberine-treated diabetic groups

圖1 對(duì)照組、胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素治療組地鼠口服糖耐量試驗(yàn)Fig 1Oralglucose tolerance tests(OGTT)in control,insulin-resistant,diabetic and berberine-treated diabetic hamsters口服葡萄糖耐量試驗(yàn)A：葡萄糖曲線;B：胰島素曲線;C：葡萄糖曲線下面積;D：胰島素曲線下面積＊與對(duì)照組比較,P＜0.05;#2型糖尿病組與治療組比較,P＜0.05

2.2 胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素治療組地鼠肝臟組織形態(tài)改變

組織形態(tài)學(xué)研究顯示,對(duì)照組地鼠肝組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)正常。胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠均出現(xiàn)肝臟脂沉積(肝脂肪變性)。胰島素抵抗地鼠的肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)中等大小和較大的脂滴并呈現(xiàn)中重度的肝臟脂肪變性。2型糖尿病地鼠的肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)中等大小和較大的脂滴并且含有較大脂滴的肝細(xì)胞數(shù)目稍增多,但亦呈現(xiàn)中重度的肝臟脂肪變性?？傮w看來,二者肝臟脂沉積程度相似,無本質(zhì)差異。黃連素治療組地鼠肝臟內(nèi)也見脂肪沉積。肝細(xì)胞內(nèi)見中小脂滴,有的僅為小脂滴并呈現(xiàn)輕中度的肝臟脂肪變性,與糖尿病地鼠肝臟的病變程度有明顯的差異(圖 2)。

2.3 胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素治療組地鼠肝臟中 SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的改變

實(shí)時(shí)定量 RT-PCR的結(jié)果(RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖見圖 3)顯示與對(duì)照組相比,胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠肝臟中 SREBPs(SREBP-1a、SREBP-1c和 SREBP-2)基因 、SCAP基因、S1P和 S2P基因的表達(dá)增加,Insigs(Insig-1和 Insig-2)基因的表達(dá)降低。SREBP-1c調(diào)節(jié)的脂肪酸合成相關(guān)靶基因,如脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶 A羧化酶(ACC)和硬脂酰輔酶 A去飽和酶 -1(SCD-1)的表達(dá)升高。SREBP-2調(diào)節(jié)的膽固醇代謝相關(guān)靶基因,如羥甲戊二酰輔酶 A合成酶(HMG CoA synthase)、羥甲戊二酰輔酶 A還原酶(HMG CoA reductase)和高密度脂蛋白受體(LDLR)的表達(dá)也增加。SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的改變?cè)谝葝u素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠之間差異存在顯著性意義 (P＜0.05)。黃連素治療后,與對(duì)照組相比,黃連素治療組地鼠肝臟中 SREBPs、SCAP、S1P、S2P、FAS、ACC、SCD-1、HMG CoA synthase、HMG CoA reductase和 LDLR的表達(dá)增加,Insigs的表達(dá)也增加。但與 2型糖尿病組地鼠相比較,黃連素治療組地鼠肝臟中 SREBPs、SCAP、S1P、S2P、FAS、ACC、SCD-1、HMG CoA synthase、HMG CoA reductase和 LDLR的表達(dá)顯著降低,Insigs的表達(dá)顯著增加。SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的改變?cè)邳S連素治療組和 2型糖尿病組之間差異存在顯著性意義 (P＜0.05)(圖 4)。

圖2 對(duì)照組、胰島素抵抗組、2型糖尿病組和黃連素治療組地鼠肝臟的形態(tài)學(xué)改變(HE染色,200×)Fig 2 Alteration in morphology of livers from control,insulin-resistant,diabetic and berberine-treated diabetic groups(H＆E stain,200×)A：對(duì)照組肝臟;B：胰島素抵抗組肝臟;C：2型糖尿病組肝臟;D：黃連素治療組肝臟

圖3 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖Fig 3 The picture of agarose gel electrophoresis of products of RT-PCR

3 討 論

胰島素抵抗是 2型糖尿病發(fā)生的重要誘發(fā)因素。糖尿病脂毒性學(xué)說提出脂誘性肝胰島素抵抗是飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān) 2型糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制之一。所以,胰島素增敏劑對(duì)脂誘性肝胰島素抵抗的治療是治療飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān) 2型糖尿病的重要策略。黃連素是作為糖尿病治療方劑的主要成份之一的中草藥黃連的主要生物活性成份之一,是一種異喹啉生物堿,具有廣泛的藥理學(xué)和生物化學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)研究顯示黃連素具有胰島素增敏劑的藥理學(xué)特性,其治療機(jī)制可能是受體后效應(yīng)[8,9]。盡管目前對(duì)黃連素降低 2型糖尿病血糖血脂作用的分子機(jī)制已有相關(guān)研究,但黃連素對(duì) 2型糖尿病胰島素抵抗,尤其是對(duì)脂誘性肝胰島素抵抗治療作用的分子機(jī)制了解甚少。本研究結(jié)果顯示 SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因參與了黃連素治療 2型糖尿病地鼠脂誘性肝胰島素抵抗。

圖4 黃連素對(duì)肝臟SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因表達(dá)的影響Fig 4 The effects of berberine on the exp ression of hepatic SREBPs,their regulating genes and their target genes＊糠尿病組與胰島素抵抗組比較,P＜0.05;#黃連素治療組與 2型糠尿病組比較,P＜0.05

SREBPs屬于轉(zhuǎn)錄因子家族,哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組編碼 3個(gè) SREBP的異構(gòu)體,分別為 SREBP-1a、SREBP-1c和 SREBP-2。SREBP-1a具有較高的轉(zhuǎn)錄活性,是所有 SREBP敏感基因的激活者,包括膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成。SREBP-1優(yōu)先增強(qiáng)脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄與脂肪酸的合成,而SREBP-2則優(yōu)先激活膽固醇的合成[10]。SREBPs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)與 SCAP、S1P、S2P、Insigs和細(xì)胞內(nèi)脂的含量及種類相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠肝臟中SREBPs、SCAP、S1P、S2P及 SREBPs靶基因的表達(dá)增加,Insigs(Insig-1和 Insig-2)的表達(dá)降低。在黃連素治療地鼠肝臟中上述基因表達(dá)相反。這些基因表達(dá)改變顯示胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠肝臟中表達(dá)增加的 SCAP基因有助于增強(qiáng)伴侶作用,護(hù)送 SREBPs到達(dá)高爾基體。表達(dá)增加的蛋白酶 S1P和 S2P基因有助于增強(qiáng)切割水解釋放出成熟的 SREBPs(nSREBPs),進(jìn)而有助于成熟的SREBPs進(jìn)入核內(nèi)誘導(dǎo)膽固醇和脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇或氧化膽固醇濃度較高時(shí),SCAP/SREBPs復(fù)合體駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇或氧化膽固醇濃度較低或排空時(shí),SCAP護(hù)送SREBPs到達(dá)高爾基體進(jìn)行水解[11]。Insigs具有與膽固醇協(xié)同抑制 SCAP/SREBPs復(fù)合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸作用[12,13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示降低表達(dá)的 Insigs似乎在細(xì)胞內(nèi)膽固醇增高時(shí)不能有效地以一個(gè)固醇依賴的方式與 SCAP相互作用并形成一個(gè) SCAP/SREBPs/Insigs復(fù)合物,使 SCAP/SREBPs復(fù)合體駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。因此,胰島素抵抗地鼠和2型糖尿病地鼠肝臟中上述 SREBPs調(diào)控基因表達(dá)的改變有助于 SREBPs基因表達(dá)產(chǎn)物的成熟及其誘導(dǎo)成脂效應(yīng)的發(fā)揮。模型地鼠肝臟增加表達(dá)的SREBPs可能主要由高脂飲食[14]或增高的血糖[15]誘導(dǎo)形成并通過此機(jī)制加速成熟并發(fā)揮成脂效應(yīng)。同時(shí),本研究結(jié)果顯示在胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠肝臟中 SREBPs的靶基因 FAS、ACC、SCD1、LDLR、HMG CoA synthase和 HMG CoA reductase的表達(dá)增加。表達(dá)增強(qiáng)的 SREBP-1c將誘導(dǎo)脂合成基因,如 FAS,ACC和 SCD1的表達(dá),增加肝臟甘油三酯的沉積[16],有助于脂誘性胰島素抵抗的形成。另外,增強(qiáng)表達(dá)的 SREBP-1c也可以通過直接抑制胰島素受體底物 2基因轉(zhuǎn)錄而抑制胰島素信號(hào)通路,從而引起或加重胰島素抵抗[17]。表達(dá)增強(qiáng)的 SREBP-2將誘導(dǎo) LDLR,HMG CoA synthase和HMG CoA reductase的表達(dá)而增加膽固醇的攝取和合成[18]。表達(dá)增強(qiáng)的 SREBP-1a似乎可以同時(shí)參與脂和膽固醇的合成[19]。因此,表達(dá)改變的 SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)將導(dǎo)致肝臟脂代謝異常和脂沉積,這將有助于胰島素抵抗地鼠和 2型糖尿病地鼠脂誘性肝胰島素抵抗的形成。黃連素逆轉(zhuǎn)了 SREBPs、其調(diào)控基因及靶基因在 2型糖尿病地鼠肝臟中的表達(dá),似乎具有 SREBPs劑量效應(yīng)調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)。黃連素降低了糖尿病狀態(tài)下表達(dá)增加的 SCAP、S1P和S2P的表達(dá)。表達(dá)降低的 SCAP有助于減弱護(hù)送SREBPs到高爾基體的伴侶作用。表達(dá)降低的 S1P和 S2P有助于減少 SREBPs的成熟,進(jìn)而有助于削弱成熟的 SREBPs對(duì)膽固醇和脂肪酸合成基因的激活效應(yīng)。同時(shí),黃連素增加了糖尿病狀態(tài)下表達(dá)降低的 Insigs的表達(dá)。表達(dá)增加的 Insigs有助于在細(xì)胞內(nèi)膽固醇增高時(shí)有效地抑制 SCAP/SREBPs復(fù)合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外輸。在黃連素治療地鼠肝臟中表達(dá)降低的 SREBPs及其靶基因?qū)⒂兄诮档透闻K的成脂過程、減輕肝脂沉積和改善脂誘性肝胰島素抵抗。這從基因表達(dá)水平上解釋了黃連素對(duì)肝臟脂代謝的調(diào)節(jié)效應(yīng)。然而,結(jié)果亦顯示,與對(duì)照相比,在黃連素治療地鼠肝臟中 SREBPs及其靶基因的表達(dá)仍然處于升高狀態(tài),但即使如此,表達(dá)增加的成脂基因似乎并沒有加重脂誘性肝胰島素抵抗和影響黃連素對(duì)脂誘性肝胰島素抵抗的治療效應(yīng)。因此,表達(dá)增加的肝臟 SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是否是進(jìn)一步降低血脂所必需的仍需進(jìn)一步研究。另外,表達(dá)增加的肝臟 SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是暫時(shí)的還是較持久的尚不清楚。因此,黃連素誘導(dǎo)的肝 SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)表達(dá)的改變有助于改善脂誘性肝胰島素抵抗,進(jìn)而防止肥胖相關(guān)糖尿病的進(jìn)展。

SREBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)參與 2型糖尿病脂誘性肝胰島素抵抗的形成及黃連素治療 2型糖尿病脂誘性肝胰島素抵抗的效應(yīng)。

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Effectsof berberine on expression of hepatic sterol regulatory element-binding protein,its control and target genes in type 2 diabetic Chinese ham sters

LIU Xu-han1,LIGuo-sheng2,HUANG Lan3,ZHU Hua3,LIU Ya-li3,MA Chun-mei3
(1.Departmentof Endocrine,Dalian Municipal Central Hospital,Dalian 116003,China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospitalof Dalian Medical University,Dalian 116011,China;3.Department of Pathology,Institute of Laboratory Anima l Science,Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)and Peking Union Medical College(PUMC),Beijing 100021,China)

[Objective]To study the effects of berberine on the exp ression of hepatic sterol regulatory element-binding p rotein(SREBPs)and their control and target genes in type 2 diabetic Chinesehamsters and explore the therapeutic molecu larmechanisms of berberineon fat-induced hepatic insulin resistance.[Methods]The insulin-resistantand type 2 diabetic Chinese hamster models were induced by high-fat diet without or with low-dose strep tozotocin.Then,the hamsters were randomly divided into 4groups：normal control,insu lin-resistant,diabetic and berberine-treated diabetic groups.After nine-week treatment,the expression of hepatic SREBPs and their control and target genes from different groups were measured by RT-PCR.[Results]It was indicated that the expression of SREBPs,SCAP,S1P,S2P and SREBPs target genes was increased and the expression of Insigs was decreased in the fatty liver ofhamstermodel.Berberine effectively improved insulin resistance and reversed the altered expression ofhepatic SREBPs and its controland targetgenes in diabetic hamsters.[Conclusion]SREBPs gene transcriptional programs are involved in the therapeutic molecu lar mechanisms of berberine on fat-induced hepatic insu lin resistance in type 2 diabetic hamsters.

berberine;type 2 diabetes;sterol regulatory element-binding p rotein;insu lin resistance;Chinese hamster;liver

R 583.1

A

1671-7295(2011)01-0023-08

2010-11-16;

2010-12-18

劉栩晗(1975-),女,遼寧錦州人,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士。E-mail：xuhanliu281277@yahoo.com.cn

李國(guó)生,主治醫(yī)師。E-mail：guoshengli998@163.com