朱 英,劉 平

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 感染科,遼寧大連 116011;2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 曙光醫(yī)院 肝病研究所,上海 201203)

一貫煎對(duì) DMN肝纖維化大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖分化的影響

朱 英1,劉 平2

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 感染科,遼寧大連 116011;2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 曙光醫(yī)院 肝病研究所,上海 201203)

[目的]探討一貫煎有效逆轉(zhuǎn)大鼠肝硬化的作用途徑,促進(jìn)中醫(yī)藥在組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)研究中的發(fā)展。[方法]二甲基亞硝胺(DMN)制備大鼠肝硬化模型,于肝硬化造模成型后,給予一貫煎治療,以Thy1.1為肝臟卵圓細(xì)胞(HOC)標(biāo)記物,通過(guò)免疫組織化學(xué)、蛋白定量檢測(cè)以及激光共聚焦檢測(cè)技術(shù),觀察一貫煎對(duì)肝臟干細(xì)胞增殖及分化及相關(guān)因子的影響。[結(jié)果]DMN大鼠肝硬化形成過(guò)程中存在 HOC的動(dòng)態(tài)變化,一貫煎組中羥脯氨酸含量減少,與模型組比較差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。Thy1.1與AFP共定位細(xì)胞像素密度值明顯增高,與模型組比較,差異有顯著性意義(P＜0.01),Thy1.1與 CK 19共定位細(xì)胞像素密度值略高于模型組,差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。[結(jié)論]具備養(yǎng)陰功能的一貫煎可誘導(dǎo) HOC向肝細(xì)胞分化,促進(jìn)已經(jīng)成型的肝硬化的逆轉(zhuǎn),重構(gòu)損傷的肝組織,從而改善肝臟功能。

一貫煎;DMN肝纖維化大鼠;肝卵圓細(xì)胞;增殖分化

肝硬化是伴隨肝臟纖維化、肝細(xì)胞損傷和肝臟功能障礙的一種慢性疾病。肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵在于病理性沉積的結(jié)締組織的降解與損傷的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再生。干細(xì)胞的增殖、分化對(duì)肝細(xì)胞的再生起主要作用。近年來(lái)大量研究表明,在抗肝纖維化的治療中,中藥復(fù)方多環(huán)節(jié)、多層次的綜合藥理學(xué)作用具有明顯的優(yōu)勢(shì)和臨床療效,同時(shí)發(fā)現(xiàn)中藥在干細(xì)胞誘導(dǎo)增殖分化方面也具有潛在的作用[1]。

本研究應(yīng)用二甲基亞硝胺(Dimetlylnit nosamine,DMN)造成類(lèi)似于人類(lèi)的大鼠肝硬化模型[2],應(yīng)用較為敏感的 Thy-1.1作為肝卵圓細(xì)胞(hepatic oval cell,HOC)標(biāo)記物,觀察 HOC在肝硬化形成與消減過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化;同時(shí)應(yīng)用雙重?zé)晒饷庖呒す夤簿劢箼z測(cè)技術(shù)觀察 HOC的分化趨向;應(yīng)用一貫煎治療,觀察這些方劑在肝硬化逆轉(zhuǎn)中的作用及其對(duì) HOC的影響,研究中醫(yī)藥在肝硬化組織重構(gòu)過(guò)程中的作用與意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

Wistar大鼠 ,雄性,體重(160±15)g,清潔級(jí) ,由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔區(qū)動(dòng)物房飼養(yǎng)、造模和觀察,自由飲食。

1.2 主要試劑

DMN為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品：lot.MAL05。羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)自日本ナカラィテスク株式會(huì)社,MIR8282。鼠抗α-SMA單克隆抗體為 Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗Thy1.1單克隆抗體為 SeroTec公司產(chǎn)品;鼠抗 CK 19和 AFP單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;兔抗 HGF多克隆抗體為 Assay Designs公司產(chǎn)品;兔抗 SCF多克隆抗體為 SantaCruz公司產(chǎn)品;兔抗TGF-β1多克隆抗體為 Bivision公司產(chǎn)品。激光共聚焦檢測(cè)用 cy3標(biāo)記(紅色)羊抗單克隆抗體及 FITC標(biāo)記(綠色)驢抗單克隆抗體均為 Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品。

1.3 藥物

一貫煎 (《柳州醫(yī)話(huà)》,由北沙參、生地、當(dāng)歸 、枸杞、川楝子組成)是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心(國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室)水煎濃縮煎出液制成流浸膏,冷凍干燥,閉光保存。

1.4 主要儀器

控制系統(tǒng) olympus PM-30;HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng),購(gòu)自同濟(jì)大千屏影像公司;復(fù)日 FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng),上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品。激光共聚焦顯微鏡,為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品,共聚焦型號(hào)為 FV1000SIMS Scanner,所用譜線(xiàn)為 488 nm、543 nm兩種激光譜線(xiàn),物鏡為 PLSAPO60X(數(shù)值孔徑為 1.4),顯微鏡型號(hào)為 IX81。

1.5 模型制備

Wistar大鼠 32只,雄性,重量為 (160±15)g。參照 Jenkins等[3]介紹的方法制備 DMN肝硬化模型。按 DMN 10mg/kg劑量(用生理鹽水稀釋)處理動(dòng)物,腹腔注射,每周連續(xù) 3 d,1次/d,共 4周。正常對(duì)照大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。

1.6 分組與給藥

于 DMN腹腔注射 4周造模完成后,將模型大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、一貫煎組每組 12只,正常對(duì)照組 8只。于第 5周第 1天起,一貫煎按 60 kg成人體重日劑量的 10倍量灌胃,1次/d,共 2周;正常對(duì)照組及模型對(duì)照組以同體積生理鹽水給予相應(yīng)處理。

1.7 樣品的采集

大鼠予戊巴比妥鈉 40mg/kg體重劑量腹腔注射麻醉后打開(kāi)腹腔,取 0.3～0.4 cm厚肝組織,OTC液包埋,液氮迅速冷凍,用恒冷切片機(jī)在 -20℃下進(jìn)行 6μm厚連續(xù)冰凍切片,用于免疫組化染色。取1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm肝組織,10%中性福爾馬林液固定,24 h后逐級(jí)酒精脫水,二甲苯透明,56℃石蠟包埋,4μm厚切片,用于免疫組化染色。取肝組織 -70℃保存以備羥脯氨酸(Hyp)及 Western Blot檢測(cè)。

1.8 觀測(cè)項(xiàng)目與方法

1.8.1 肝組織 Hyp含量檢測(cè)：采用 Jamall氏法[3]。

1.8.2 肝組織 α-SMA、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF免疫組化觀測(cè)：應(yīng)用 Envision法檢測(cè)。其中Thy1.1和 TGFβ1采用冰凍肝組織切片,α-SMA、HGF和 SCF采用石蠟切片。

1.8.3 肝組織 α-SMA、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF蛋白定量分析：用免疫印跡法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.4 肝組織 AFP、CK 19與 Thy1.1共定位：采用冰凍肝組織切片,應(yīng)用雙重?zé)晒饷庖吖簿劢辜す鈷呙栾@微鏡技術(shù)檢測(cè)(Double Immuno Confocal Laser Scan Microscopy,DICLSM)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS10.0中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,并用 LSD程序進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)的變化

2.1.1 肝組織 Hyp含量的變化：與正常對(duì)照組大鼠比較,模型對(duì)照組的肝組織 Hyp含量顯著增加(P＜0.01);與模型對(duì)照組相比,一貫煎組有所降低,但差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)(圖 1)。

2.1.2 肝組織 α-SMA蛋白表達(dá)的變化：α-SMA免疫組化結(jié)果顯示,終止 DMN刺激后 2周,即 6周模型對(duì)照組大鼠肝組織 α-SMA表達(dá)明顯多于正常對(duì)照組,主要表達(dá)于星狀細(xì)胞,位于匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇部位。與模型對(duì)照組大鼠比較,一貫煎組α-SMA表達(dá)明顯減少,蛋白免疫印跡分析結(jié)果與免疫組化陽(yáng)性染色動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致(圖 2)。

圖1 肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量的變化Fig 1 Change of hyd roxyp roling content in liver tissue Normal：正常組 ;Model：模型組 ;YGJ：一貫煎組

圖2 肝組織 α-SMA免疫組織化學(xué)與免疫印跡檢測(cè)Fig 2 Immunohistochem istry and Immunoblot ofα-SMA in liver tissueA：正常組(N);B：模型組(M);C：一貫煎組(J)

2.2 肝卵圓細(xì)胞標(biāo)志物的變化

2.2.1 肝組織 Thy1.1蛋白表達(dá)的變化：肝組織Thy1.1免疫組化顯示,模型對(duì)照組大鼠肝組織的Thy1.1高度表達(dá)于肝臟卵圓細(xì)胞,為胞膜染色,主要位于匯管區(qū)及纖維間隔周?chē)?新生膽管上皮細(xì)胞明顯染色。與模型對(duì)照組比較,一貫煎組陽(yáng)性染色細(xì)胞增加,蛋白免疫印跡分析結(jié)果與免疫組化染色變化趨勢(shì)基本一致(圖 3)。

2.2.2 DICLSM檢測(cè)肝組織 AFP、CK 19與 Thy1.1共定位：AFP與 Thy1.1共定位的變化：正常對(duì)照組大鼠肝組織中未見(jiàn)到 AFP與 Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),6周模型大鼠有較多表達(dá)。與模型對(duì)照組比較,一貫煎組陽(yáng)性表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)(圖 4)。胞;A 2,Thy1.1熒光染色,無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)胞;A3,AFP與 Thy1.1共聚焦染色,無(wú)共定位染色細(xì)胞;A 4,共定位細(xì)胞密度分布為零。

圖3 肝組織Thy1.1免疫組化與免疫印跡染色Fig 3 Immunohistochem istry and Immunoblot of Thy1.1 in liver tissueA：肝臟 Thy1.1免疫組化陽(yáng)性染色細(xì)胞變化(100×)。A 1：正常組(N),未見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞。A 2：模型組(M)終止造模后 2周,匯管區(qū)出現(xiàn)大量陽(yáng)性染色細(xì)胞,形成團(tuán)簇樣,并形成膽小管。A 3：一貫煎組(J),匯管區(qū)出現(xiàn)大量陽(yáng)性染色細(xì)胞,多于模型組B：肝臟 Thy1.1免疫組化陽(yáng)性染色細(xì)胞變化(400×)。B1：正常組(N),未見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞。B2：模型組(M)終止造模后 2周,匯管區(qū)出現(xiàn)大量陽(yáng)性染色細(xì)胞,形成團(tuán)簇樣,并形成膽小管。B 3：一貫煎組(J),匯管區(qū)出現(xiàn)大量陽(yáng)性染色細(xì)胞,多于模型組

圖4 DICLSM檢測(cè)肝組織 AFP與 Thy1.1共定位Fig 4Colocalization of AFP and Thy1.1 in liver tissueA：正常組(Normal)：A 1,肝組織 AFP熒光染色,無(wú)陽(yáng)性染色細(xì)

B：模型組(Model)：B1,肝組織 AFP熒光染色,出現(xiàn)紅色染色細(xì)胞;B2,肝組織 Thy1.1熒光染色,出現(xiàn)綠色染色細(xì)胞;B3,AFP與Thy1.1共聚焦染色,出現(xiàn)黃色共定位染色細(xì)胞;B4,共定位細(xì)胞密度分布增加。

C：一貫煎組(YGJ)：C 1,肝組織 AFP熒光染色,綠色染色細(xì)胞多于模型組;C2,肝組織 Thy1.1熒光染色,綠色染色細(xì)胞多于模型組;C3,AFP與 Thy1.1共聚焦染色,黃色共定位染色細(xì)胞多于模型組;C4,共定位細(xì)胞密度分布多于模型組。

CK19與 Thy1.1共定位的變化：正常對(duì)照大鼠肝組織中未見(jiàn)到 CK19與 Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞,6周模型對(duì)照組大鼠有顯著表達(dá)。一貫煎組陽(yáng)性表達(dá)量與模型對(duì)照組比較,差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)(圖 5)。

2.3 HGF、SCF及 TGFβ1等生長(zhǎng)因子變化

2.3.1 肝組織 HGF蛋白表達(dá)變化：正常對(duì)照組大鼠肝組織中 HGF蛋白呈較高水平表達(dá);模型對(duì)照組大鼠僅有微量表達(dá);與模型對(duì)照組比較,一貫煎組蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(圖 6)。

圖5 DICLSM檢測(cè)肝組織 CK 19與 Thy1.1共定位Fig 5 Colocalization of CK19and Thy1.1 in liver tissue

圖6 肝組織HGF免疫印記Fig 6 Immu noblot of HGF in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

2.3.2 肝組織 SCF蛋白表達(dá)變化：正常對(duì)照組大鼠肝組織中可見(jiàn) SCF蛋白少量表達(dá),模型對(duì)照組表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組;與模型對(duì)照組比較,一貫煎組表達(dá)減少。該結(jié)果與肝組織 SCF免疫組化陽(yáng)性染色變化趨勢(shì)基本一致(圖 7)。

圖7 肝組織SCF免疫印記Fig 7 Immunoblotof SCF in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

2.3.3 肝組織 TGFβ1蛋白表達(dá)變化：正常對(duì)照組大鼠肝組織中未見(jiàn)到 TGFβ1蛋白表達(dá),而 DMN模型對(duì)照組有大量表達(dá);與模型對(duì)照組比較,一貫煎組無(wú)顯著變化,接近模型對(duì)照組水平(圖 8)。

圖8 肝組織 TGFβ1免疫印記Fig 8 Immunoblot of TGFβ1 in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

3 討 論

目前,纖維化或早期硬化組織器官的結(jié)構(gòu)重構(gòu)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中的重大科學(xué)問(wèn)題,而干細(xì)胞已成為組織器官結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程中的研究焦點(diǎn)?，F(xiàn)有研究顯示肝組織中存在干細(xì)胞并參與了肝細(xì)胞再生和肝損傷修復(fù),骨髓、胚胎等多種來(lái)源的干細(xì)胞也具有向肝細(xì)胞分化的潛能,這些結(jié)果顯示了從干細(xì)胞的角度探討肝細(xì)胞再生機(jī)制及再生肝臟功能的可行性和重要性。

關(guān)于干細(xì)胞(stem cells,SC)的研究發(fā)現(xiàn),肝組織中存在有肝再生的種子細(xì)胞,即肝干細(xì)胞(hepatic stem cells,HSC),這些細(xì)胞在一定的條件下,可以增生分化為肝細(xì)胞[4]。在嚴(yán)重肝損傷時(shí),如當(dāng)肝組織損傷為廣泛和慢性的或者肝細(xì)胞的增殖被抑制(如病毒感染)時(shí),HSC被激活。在正常成年肝細(xì)胞(hepatic cell,HC)更新過(guò)程中有低水平、基礎(chǔ)狀態(tài)的 HSC參與分化。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,HSC主要以成肝細(xì)胞的形式存在,而在成年組織則以卵圓細(xì)胞(hepatic oval cell,HOC)和小肝細(xì)胞(small hepatocyte-like progenitor cells,SHPC)的形式存在。在人慢性肝臟疾病中,HOC和疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)和成熟肝細(xì)胞的增生抑制有關(guān)[5]。

本研究表明,DMN大鼠肝硬化形成過(guò)程中存在HOC的動(dòng)態(tài)變化,即細(xì)胞的數(shù)量隨著肝纖維化程度的不斷加重而增加;在停止 DMN造模 2周后,即于肝纖維化開(kāi)始消減時(shí),該細(xì)胞數(shù)量的增加更為顯著,隨著肝纖維化的消減、停止 DMN造模 4周后,其數(shù)量有所減少[5]。表明 HOC的此種動(dòng)態(tài)變化與大鼠肝硬化的形成與消減的病理變化有關(guān),尤其對(duì)肝纖維化的消減具有重要病理生理意義。干細(xì)胞因子(SCF)表達(dá)對(duì) DMN大鼠肝硬化形成與消減過(guò)程中HOC數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化具有重要作用,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ1)在肝硬化形成與逆轉(zhuǎn)過(guò)程中可能起到控制HOC過(guò)度增殖的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)中,一貫煎可顯著降低血清 AST、T.Bil水平;也有一定降低肝組織Hyp含量的作用,改善肝組織炎癥和纖維化程度;減少肝組織 α-SMA的表達(dá);提高 Thy1.1的表達(dá),可顯著提高 Thy1.1和 AFP共定位細(xì)胞的表達(dá)。

在 DMN大鼠肝硬化模型中,一貫煎能夠降低血清 AST、T.Bil和肝組織 α-SMA水平,同時(shí)在DMN大鼠肝硬化的逆轉(zhuǎn)過(guò)程中能夠增加 Thy1.1標(biāo)記的 HOC的數(shù)量,并明顯增加 Thy1.1與 AFP共定位細(xì)胞數(shù)量。表明具有養(yǎng)陰功效的一貫煎在 DMN大鼠肝硬化逆轉(zhuǎn)過(guò)程中,也可有效促進(jìn) HOC的活化和增殖,通過(guò)改善肝臟微環(huán)境主要誘導(dǎo) HOC向肝細(xì)胞分化,同時(shí)也有誘導(dǎo) HOC向膽管上皮細(xì)胞分化的作用,從而改善 DMN大鼠肝硬化的肝功能和肝組織病理,重構(gòu)損傷的肝臟,以利于肝硬化的逆轉(zhuǎn)。因此,養(yǎng)陰一貫煎可促進(jìn) DMN大鼠肝硬化的逆轉(zhuǎn)過(guò)程中 HOC的增殖,重在誘導(dǎo) HOC向肝細(xì)胞的分化。進(jìn)一步深入研究該方劑誘導(dǎo) HOC分化的作用機(jī)制不僅有重要的應(yīng)用價(jià)值,對(duì)中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究也將有重要的理論意義。

[1]慕永平,劉平,龍愛(ài)華,等.CCl4大鼠肝硬化成型階段中醫(yī)方證病機(jī)的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,26(4)：344-347.

[2]朱英,劉平.Thy1.1陽(yáng)性肝臟卵圓細(xì)胞在大鼠肝硬化形成與消減過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J].中華肝臟病雜志,2005,13(11)：823-827.

[3]Jenkins SA,Grandison A,Baxter JN,et al.A dimethylnitrosamine-inducedmodelof cirrhosis and portal hypertension in the rat[J].JHepatol,1985,1：489-499.

[4]Laurson J,Selden C,Hodgson HJ.Hepatocyte progenitors in man and in rodents-multiple pathway,multip le candidates[J].Int JExp pathol,2005,86：1-18.

[5]耿瑩,韓明子,洪鈺,等.不同移植途徑對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞遷移至肝臟及分化的影響[J].中華器官移植雜志,2008,29(7)：402-404.

[6]朱英,劉平.肝臟卵圓細(xì)胞定向分化在二甲基亞硝胺大鼠肝硬化消減過(guò)程中的意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(2)：106-109.

Effect of YGJ on proliferation and differenciation of hepatic oval cells in rat cirrhosisby DMN

ZHU Ying1,LIU Ping2
(1.Department of Infectious Disease,the First Affiliatde Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China;2.Institute of Liver Disease,ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine,Shanghai 201203,China)

[Objective]Discuss effectof YGJ in cirrhosis reverse,promote development of chinese traditionalmedicine in tissue remodeling.[Methods]Ratcirrhosismodelwas set up by dimethylnitrosamine(DMN),treated with YGJaftermodeling.Thy1.1was used asmarker ofhepatic oval cells(HOCs).Immunohistochemistry,Immunoblotand DICLSM were app llied to detect effect of YGJon proliferation and differenciation of HOC and interrelated faction in rat cirrhosis.[Results]There was dynamics change during cirrhosis progress.Contentof hyd roxyp roling(Hpy)decreased in YGJ.There was significantmeaning compared with themodel(P＜0.01).Pixel density of colocalized cells of AFPand Thy1.1 was obvious higher.There was significantmeaning compared with themodel(P＜0.01),thatof CK 19and Thy1.1were slighter higher,and no significantmeaning compared with themodel(P＞0.05).[Conclusion]YGJwith function of nourishing Yin will induce HOCs differentiate into hepatocytes,promote cirrhosis reverse,rebuilt damaged liver tissue,improve liver function.

YGJ;cirrhosis of ratby DMN;hepatic oval cells(HOCs);p roliferation and differentiation

R 575.2

A

1671-7295(2011)01-0011-06

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(L2010128);遼寧省醫(yī)學(xué)高峰建設(shè)工程項(xiàng)目(200919);大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009E12SF153);大連市科技局國(guó)際合作項(xiàng)目(2009F11GH 178)

2010-12-08;

2010-12-15

朱 英(1965-),女,江蘇無(wú)錫人,主任醫(yī)師,博士。 E-mail：zhuuyingshu52@126.com

劉 平,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail：liuliver@online.sh.cn