郭 權(quán) ,畢 偉

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院急診科,遼寧大連 116011;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,遼寧大連 116011)

大承氣湯對(duì)重癥胰腺炎 SIRS大鼠腹腔巨噬細(xì)胞sCD14作用的實(shí)驗(yàn)研究

郭 權(quán)1,畢 偉2

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院急診科,遼寧大連 116011;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,遼寧大連 116011)

[目的]研究大承氣湯對(duì)重癥胰腺炎SIRS大鼠腹腔巨噬細(xì)胞sCD 14的作用機(jī)制。[方法]建立重癥急性胰腺炎(SAP)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)大鼠模型。分為 5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：正常組、SIRS模型組、中藥組、西藥組、中西結(jié)合組。用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)技術(shù)檢測(cè)不同處理組中 sCD14的濃度。[結(jié)果]檢測(cè)SAP大鼠腹腔 MΦsCD 14的濃度發(fā)現(xiàn)：中西醫(yī)結(jié)合治療組明顯低于SIRS組(31.83±29.51)vs(272.82±40.68),P＜0.05;中西醫(yī)結(jié)合治療組低于中藥組和西藥組,分別為(31.83±29.51)vs(88.97±54.8),P＜0.05和(31.83±29.51)vs(83.45±35.21),P＜0.05;中西醫(yī)結(jié)合治療組與正常組比較差異無顯著性意義(31.83±29.51)vs(31.30±24.30),P＞0.05。[結(jié)論]大承氣湯治療重癥急性胰腺炎/全身炎癥反應(yīng)綜合征時(shí)對(duì)腹腔MΦsCD 14有明顯的抑制作用。

大承氣湯;重癥急性胰腺炎;SIRS;巨噬細(xì)胞;sCD 14

全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是多器官功能不全綜合征(MODS)和多器官衰竭(MSOF)的前期表現(xiàn)。阻斷 SIRS向 MODS的進(jìn)展是降低諸如重癥狀急性胰腺炎等危重病死亡率的關(guān)鍵,所以 SIRS的早期診斷和治療就顯得尤為重要。SIRS的發(fā)生與幾組細(xì)胞的激活和多種炎性介質(zhì)的失控釋放有關(guān)：這些細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等;炎性介質(zhì)包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL-1、IL-6、IL-8)、血小板激活因子 (PAF)、氧自由基(OFR)等。在正常情況下,中性粒細(xì)胞(PMN)以凋亡的形式被巨噬細(xì)胞[1](MΦ)識(shí)別、吞噬而清除,限制組織損傷、抑制高炎反應(yīng)、促進(jìn)炎癥吸收。如果在感染或創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)下 PTN凋亡延遲、釋放的胞內(nèi)有毒物質(zhì)將加重局部炎癥反應(yīng)從而加重 SIRS。近年來研究表明,大承氣湯能有效的防止腸道細(xì)菌移位,對(duì)內(nèi)毒素性重癥狀急性胰腺炎 SAP/SIRS患者的病情有所改善。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠重癥急性胰腺炎全身炎癥狀反應(yīng)綜合征模型,研究大承氣湯對(duì)重癥急性胰腺炎 SIRS大鼠腹腔 MΦsCD14的作用。闡明腹腔 MΦ在急性胰腺炎 SIRS中的變化及可能機(jī)制,為臨床藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組：健康雄性(SD)大鼠,體重220～250g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為 5組：正常組、模型組、中藥組、西藥組、中西結(jié)合組,每組 15只。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器：臺(tái)式高速低溫離心機(jī);PH240A型培養(yǎng)箱;HWS-20恒溫水浴箱;流式細(xì)胞儀;酶標(biāo)儀。

1.1.3 主要試劑盒及藥品：可溶性 CD14(sCD14)酶聯(lián)免疫分析試劑盒;地塞米松磷酸鈉注射液;PBS;小牛血清;大承氣湯由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥制劑科制成。

1.2 方 法

1.2.1 SAP/SIRS的 SD大鼠模型制備：模型組制備：用無菌 10%水合氯醛腹腔麻醉,腹壁正中線切口顯露十二指腸,在十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸壁插入 1 mL小注射器針頭入膽胰管,同時(shí)在膽管出肝門處用無損傷小動(dòng)脈夾夾閉,逆行緩慢注入 1.5%去氧膽酸鈉,觀察胰腺有充血改變后,退出針頭,去掉動(dòng)脈夾,十二指腸復(fù)位,縫合關(guān)腹。正常組(假手術(shù)組)僅開腹后翻動(dòng)胰腺數(shù)次,關(guān)腹。藥物治療：中藥大承氣湯經(jīng)口注入;地塞米松經(jīng)腹腔內(nèi)注射,各治療組于造模后立即給藥 1次(術(shù)后 2 h)和造模后 12 h再次給藥。正常組(假手術(shù)組)經(jīng)口注入生理鹽水。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞(PMΦ)的分離方法：SD大鼠術(shù)后 24 h,各組 SD大鼠麻醉奏效后,取腹壁正中線處注入 3～4 m L冰中預(yù)冷的無菌 PBS-H,輕按腹部 5min;剪開腹壁,注射器吸出腹腔液,再用等量的預(yù)冷 PBS-H沖洗腹腔 2～3次,合并滲出液于離心管中離心,1000 r/min(R=10 cm),離心 10 min,取上清;將各組收集的上清注入 EP管中,做好標(biāo)記后放入 -80℃冰箱中待測(cè)。

1.2.3 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察：切取部分胰腺組織,切片,常規(guī) HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,按照Kaiser[2]胰腺組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表 1。

表 1 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分Tab 1 The pathology score of pancreatic tissue

1.2.4 各組腹腔巨噬細(xì)胞 sCD14的檢測(cè)：應(yīng)用大鼠可溶性 CD14酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒。具體步驟：設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。用酶標(biāo)儀在 450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(A值)。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,查出相應(yīng)濃度,再乘以稀釋倍數(shù);計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的 A值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用 t檢驗(yàn)及單因素方差分析法,檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物的一般情況

所有造模 SD大鼠在注射 1.5%去氧膽酸鈉溶液后均逐漸出現(xiàn)蜷縮、悚毛、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn),呼吸急促、淺快,并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重,后期皮膚黏膜發(fā)紺,大鼠呈現(xiàn)昏迷狀態(tài),嚴(yán)重者死亡。

2.2 大體解剖觀察

在膽胰管逆行注射 1.5%去氧膽酸鈉溶液后,SD大鼠的胰腺立即出現(xiàn)明顯的局限或彌漫性充血水腫,包膜張力增加。存活大鼠開腹后可見胰腺出血壞死,腹腔內(nèi)有大量血性腹水。在大網(wǎng)膜及膽總管處發(fā)現(xiàn)淺黃色的皂化斑;SD大鼠的肺也出現(xiàn)充血、水腫、出血;胃腸明顯水腫,出現(xiàn)麻痹性擴(kuò)張;肝臟稍微腫大,有出血點(diǎn);雙腎明顯增大,顏色也由淺紅色變成暗紅色。而假手術(shù)組僅見胃腸黏膜輕度水腫,顏色略帶暗紅,腹腔內(nèi)見少量滲出,肝、腎、胰腺未見明顯改變。

2.3 光鏡下胰腺組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組胰腺小葉結(jié)構(gòu)清晰。SAP/SIRS模型組胰腺實(shí)質(zhì)大片壞死,出血及脂肪變性,大量紅細(xì)胞淤積,血管擴(kuò)張,見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于組織間隙及實(shí)質(zhì)內(nèi)。見表 2。

表 2 各組SD大鼠胰腺組織光鏡下病理評(píng)分Tab 2 The pathological scoring of pancreatic tissue under lightmicroscope in SD rats of each group

2.4 各組巨噬細(xì)胞 sCD14吸光度(A值)、濃度分析

經(jīng)分析可以明確各組巨噬細(xì)胞 sCD14吸光度(A值)及濃度的變化,中西結(jié)合組與正常組比較差異無顯著性意義;中西結(jié)合組與模型組、中藥組、西藥組比較差異均有顯著性意義;特別是中西結(jié)合組與模型組比較,sCD14濃度明顯下降。見表 3。

表 3 各組巨噬細(xì)胞 sCD 14吸光度(A值)、濃度統(tǒng)計(jì)分析Tab 3The statistical analysis of optical density(A value)and concentration of sCD14ofmacrophage in SD rats of each group

3 討 論

全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)可由菌血癥、真菌血癥等及嚴(yán)重創(chuàng)傷、重癥急性胰腺炎等感染或非感染因素引起。通過激活炎癥細(xì)胞引起機(jī)體持續(xù)過度的炎癥反應(yīng),致使細(xì)胞因子、自由基、補(bǔ)體系統(tǒng)和其他多種炎性介質(zhì)的大量釋放,最終導(dǎo)致 SIRS的發(fā)生[3]。巨噬細(xì)胞(MΦ)具有消化和殺傷侵入微生物的能力,激活的 MΦ能釋放可溶性物質(zhì)和氧化代謝產(chǎn)物,是機(jī)體防御和炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的最大來源。MΦ能夠吞噬細(xì)胞碎片、衰老或凋亡細(xì)胞、塵粒、病原菌等,具有較強(qiáng)的吞噬能力。研究表明,MΦ吞噬凋亡中性粒細(xì)胞后,通過產(chǎn)生抗炎癥細(xì)胞因子 TGF-β1來抑制炎癥因子 IL-1B、TNF-a等的產(chǎn)生,并抑制 MΦ遞呈凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原[4],此時(shí)并不造成凋亡細(xì)胞的溶酶體、線粒體及細(xì)胞膜破裂,不引起炎癥反應(yīng)和周圍組織損傷,故 MΦ的吞噬功能在炎癥轉(zhuǎn)歸方面有著重要意義。如果 MΦ識(shí)別、吞噬凋亡細(xì)胞的機(jī)制受損,凋亡細(xì)胞不能被及時(shí)吞噬,即會(huì)腫脹、裂解、釋放毒性內(nèi)容物,引起周圍組織和細(xì)胞的進(jìn)一步損害。重癥急性胰腺炎 SIRS時(shí)腹水使腹腔 MΦ對(duì)凋亡細(xì)胞的清除能力下降[5],從而引起失控的 SIRS和 MODS。

CD14是 SIRS時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生內(nèi)毒素(LPS)的特異性受體,受 LPS對(duì)其分泌表達(dá)的調(diào)節(jié),接受 LPS信號(hào)激活的單核巨噬細(xì)胞 CD14的合成表達(dá)增加。CD14主要分布于單核巨噬細(xì)胞表面,以腹腔 MΦ表達(dá)較強(qiáng)。CD14以膜性 CD14(mCD 14)和可溶性CD14(sCD 14)兩種形式存在,mCD14排泄或入血形成 sCD14,mCD14是 MΦ識(shí)別和吞噬凋亡細(xì)胞的主要受體之一。sCD14參與 LPS等多種病原體成分與細(xì)胞間反應(yīng),在其中表現(xiàn)出抑制和活化雙重作用,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在生理狀態(tài)下 sCD14還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫以及脂類轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞接受 LPS炎癥信號(hào)刺激時(shí),通過 mCD14信號(hào)傳導(dǎo)通路分泌多種細(xì)胞因子。而對(duì)于一些無 mCD14的炎性細(xì)胞對(duì) LPS的刺激反應(yīng)則主要由 sCD14來介導(dǎo),sCD14與 LPS或革蘭陰性菌的結(jié)合又可降低LPS對(duì)單核細(xì)胞的過度刺激,使單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)減弱,防止了一些炎性損傷因子的過度翻譯,形成利于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。在急性胰腺炎SIRS早期,可能是受到腸道革蘭陰性菌及其內(nèi)毒素影響所致[6],mCD14和 sCD14呈同步升高,可能是機(jī)體自身調(diào)節(jié)的結(jié)果;sCD14升高可能的作用：機(jī)體要清除外來的抗原性物質(zhì),同時(shí)又要防止自身細(xì)胞的損傷。高濃度的 sCD14競(jìng)爭(zhēng)性地抑制 LPS與mCD14的結(jié)合,抑制 LPS對(duì)單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的激活作用。提示單核巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中存在著損傷和抗損傷的作用,體現(xiàn)了單核巨噬細(xì)胞功能的完整性。

大承氣湯有效成分是大黃、厚樸、枳實(shí)與芒硝。其中大黃具有抑酶、抑菌、導(dǎo)瀉、解除膽道 oddi括約肌痙攣功效,而且具有活血化癖、改善微循環(huán)、清除胃腸道內(nèi)細(xì)菌和毒素[7],改善胃腸黏膜血流灌注的作用。大黃還能降低嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染等患者應(yīng)激性腸黏膜病變、多器官功能失調(diào)綜合征的發(fā)生率,能明顯降低多器官功能失調(diào)綜合征患者血漿腫瘤壞死因子 -α、內(nèi)毒素含量,能提高重癥急性胰腺炎治愈率。中藥厚樸中含有生物活性物質(zhì)厚樸酚,有治療實(shí)熱內(nèi)阻、腑氣不行,下氣除滿之功效;芒硝咸寒潤(rùn)降、瀉熱通便,促黃疸消退。枳實(shí)有行氣消痞之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大承氣湯可明顯改善大鼠重癥急性胰腺炎的機(jī)體內(nèi)環(huán)境,大鼠腹腔 MΦsCD 14水平在 SIRS組升高,應(yīng)用中藥大承氣湯組較模型組明顯下降(P＜0.05),提示大承氣湯能有效減緩胰腺炎的進(jìn)展。目前,大承氣湯已經(jīng)廣泛用于如重癥急性胰腺炎等危重病的治療,隨著對(duì)其藥理作用的深入研究,大承氣湯有望成為臨床上治療重癥急性胰腺炎的常規(guī)用藥。

糖皮質(zhì)激素通過受體的介導(dǎo),作用炎癥的起始環(huán)節(jié),具有抑制炎性滲出、白細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的生成和釋放作用,是很強(qiáng)的抗炎激素,能降低重癥胰腺炎時(shí)胰腺的壞死程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),地塞米松能顯著改善胰腺的病理狀態(tài),同時(shí)能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。地塞米松治療組腹腔 MΦsCD14蛋白的表達(dá)水平明顯低于 SAP/SIRS模型組(P＜0.05)。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)急性炎癥患者接受糖皮質(zhì)激素治療時(shí),血清 sCD14的濃度和外周血單核細(xì)胞mCD14R的表達(dá)都被顯著抑制。有研究發(fā)現(xiàn),在體外低劑量地塞米松對(duì)小鼠MΦ的吞噬功能有明顯的抑制作用[8]。這些與本實(shí)驗(yàn)地塞米松在體外的作用一致。

重癥急性胰腺炎 SIRS時(shí)腹腔 MΦSCD14水平明顯升高,可能與內(nèi)毒素脂蛋白(LPS)調(diào)節(jié)相關(guān);大承氣湯聯(lián)合地塞米松用藥使 SAP/SIRS大鼠腹腔MΦSCD14濃度下調(diào)作用最為顯著。

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Study of function sCD 14 of Da Cheng Qi Tang SIRS in severe acute pancreatitis in rat peritonealmacrophages

GUO Quan1,BIWei2
(1.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China;2.Departmentof Surgery,the First Affiliated Hospitalof Dalian Medical University,Dalian 116011,China)

[Objective]To study the function of app lied Da Cheng Qi Tang to SIRS in severe acute pancreatitis in SAP/SIRS rat peritonealmacrophage sCD 14.[Methods]Severe acute pancreatitis SIRS ratmodel was set up.Five groups included control,SIRS,traditionalmedicine,westernmedicine,integrated traditional and westernmedicine groups.Concentration of sCD14was detected by ELISA in all of the groups.[Results]PMΦs in integrated traditional and western medicine groups wereobviously lower than that in SIRS group(31.83±29.51)vs(272.82±40.68),P＜0.05,and it in integrated traditionaland westernmedicine group was obviously lower than that in traditionalmedicineand westernmedicine groups respectively(31.83±29.51)vs(88.97±54.80),P＜0.05;(31.83±29.51)vs(83.45±35.21),P＜0.05.There was no difference between integrated traditional and westernmedicine group and control group(31.83±29.51)vs(31.30±24.30),P＞0.05.[Conclusion]Da Cheng Qi Tang treatmenthas inhibiting effect on PMΦsCD 14 in SAP/SIRS.

Da Cheng Qi Tang;severe acute pancreatitis;SIRS;macrophage;sCD 14

R 576

A

1671-7295(2011)01-0036-04

2010-10-11;

2010-11-22

郭 權(quán)(1970-),男,遼寧錦州人,副教授,碩士。E-mail：xiangermuyou@sina.com