李 勇 胡興明 鄧 文 葉楚華

(湖北省農業(yè)科學院經濟作物研究所,湖北武漢 430070)

桑葉功能活性物質提取工藝研究進展

李 勇 胡興明 鄧 文 葉楚華

(湖北省農業(yè)科學院經濟作物研究所,湖北武漢 430070)

對近年來有關桑葉中多糖類、黃酮類及生物堿類活性物質的提取工藝研究進行了綜述,為桑葉資源進一步的研究和開發(fā)提供依據。

桑葉;活性物質;多糖;黃酮;生物堿;提取工藝

中國是桑樹的故鄉(xiāng)也是世界上主要的桑葉產地之一。桑葉為桑屬植物桑樹(Morus alba L.)的葉子,隨著科技的不斷進步,人們對桑葉的化學成分、生理功能進行了深入研究,發(fā)現桑葉中含有豐富的多糖類、黃酮類和生物堿類等多種功能活性成分,具有降血糖、降血壓、降血脂及抗病毒等諸多功效［1］。桑葉因其極高的營養(yǎng)、藥用價值,已成為食品、醫(yī)藥界關注的熱點。為此,我們對近年來有關桑葉中多糖類、黃酮類及生物堿類等主要功能活性物質的提取工藝研究進展進行綜述,以期為合理開發(fā)利用桑葉資源提供依據。

1 桑葉多糖類活性物質提取工藝研究

多糖是所有生命有機體的重要組成成分與維持生命所必需的結構材料,參與生物細胞的各種活動,具有多方面的生物活性和功能。現代醫(yī)學證明,桑葉總多糖對四氧嘧啶造成的大鼠糖尿病有顯著的降血糖作用,而且多糖作為藥物對人和動物沒有毒副作用［2］,因而對于桑葉多糖的研究已引起人們的極大興趣。多糖的提取方法很多,一般桑葉多糖多采用水浸提,或輔以微波法、超聲波法、酶法或超高壓法等處理方法來提取分離。

1.1 水浸提法

桑葉多糖的水浸提法工藝一般是桑葉經超微粉碎后,于適量蒸餾水中保持恒溫提取一定時間,經離心、濃縮、Sevag法或其它方法脫蛋白、無水乙醇沉淀和干燥處理等工藝得桑葉粗多糖。劉詠［3］利用水煮醇沉法從桑葉中提取可溶性多糖,通過 Sevag法除蛋白,粗多糖過葡聚糖凝膠(Sephadex G-100)柱層析進行純化分離,用苯酚—硫酸法測定多糖含量,并用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度檢查,通過正交試驗確定了提取桑葉多糖的優(yōu)化條件為水浴溫度100 ℃、桑葉 ∶水量 =1∶100(w/v)、浸提 60 min、pH值 4為最佳提取條件,其多糖含量達 98.52 mg/g(DW)。劉樹興等［4］利用水浸提法,通過三氯乙酸法除去多糖中的蛋白質,用苯酚—硫酸法測定多糖的含量,利用正交試驗確定出桑葉多糖提取的最優(yōu)化條件為水浴溫度 100℃、pH值 1l、料液比(桑葉∶水)=1∶50(w/v)、浸提 2 h,提取率達 90.5%。張琳華等［5］采用 L9(34)正交試驗,對影響多糖的水提取工藝和醇沉分離工藝的因素水平進行了研究,比較了稀酸、稀堿、蒸餾水 3種提取方法和不同蛋白去除法對多糖提取分離的影響,結果表明:桑葉多糖的最佳提取工藝為用 10倍的蒸餾水在 70℃下提取 2次,每次 1.5 h;醇沉分離最佳工藝是醇沉時乙醇體積分數 80%,藥液濃縮至 1m L/g,pH值 4。用三氯乙酸(TCA)法去除蛋白質的效果優(yōu)于傳統(tǒng)的 Savage法。應芝等［6］利用響應面分析法(RSM)優(yōu)化桑葉多糖的提取工藝。采用單因素試驗選取試驗因素與水平。根據中心組合(Box-Benhnken)試驗設計原理,采用 4因素 3水平的響應面分析法;在分析各因素顯著性及其交互作用的基礎上,得出桑葉多糖的最佳提取工藝條件:提取溫度 77℃,料液比1∶17,提取時間 85min,提取 2次,實際測得的桑葉多糖得率為 4.67%,與模型預測值基本相符。

1.2 微波輔助法

隨著微波化學新技術的發(fā)展,新的微波破壁提取分離技術已經應用于各種天然有機物的提取工藝研究。因為超高頻率的微波快速加熱,使植物細胞部分破裂,多糖等胞內成分易擴散至細胞外溶劑中,從而明顯提高浸出率。

邢東旭等［7］以干燥桑葉粉為材料,在單因素實驗的基礎上,采用 Box-Benhnken中心組合實驗和響應面分析法,研究了提取時間、微波功率和料液比對桑葉多糖提取率的影響,確定了微波提取桑葉多糖的最佳工藝條件:微波時間 10 min,微波功率320W,料液比 1∶45,在此最優(yōu)工藝下桑葉多糖提取率的理論值為 5.45%;與熱水浸提法相比,微波法提取率高,且所得桑葉多糖更能明顯提高四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量,是一種更好的桑葉多糖提取方法。王尉等［8］利用微波輔助技術進行桑葉多糖提取,通過單因素實驗確定因素與水平,應用 Box-Behnken設計 3因素 3水平的試驗,依據回歸分析確定了最優(yōu)的提取工藝條件,結果表明微波輔助提取桑葉多糖的優(yōu)化提取工藝條件:溫度 88℃、時間11min和液固比 18∶1,提取的多糖含量為15.20mg/g,微波輔助提取的多糖含量分別比傳統(tǒng)水提法提取10min和 60min時,高 2.18倍和 0.23倍。

1.3 超聲波輔助法

超聲波是一種彈性機械振動波,它可以產生強烈振動、高速度、強烈的空化效應以及攪拌作用,能夠破壞植物細胞的細胞膜,從而加速有效成分的釋放與溶出。與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比,該法提取率高,提取速度快,作為植物功能活性成分提取新工藝,有很好的應用前景。

劉學軍等［9］研究了超聲波提取桑葉多糖工藝中超聲波功率、溫度、時間和粒徑對桑葉多糖提取率的影響,并利用正交實驗對上述 4個工藝參數進行了優(yōu)化,結果表明:超聲波提取桑葉多糖的最佳工藝條件為超聲波功率 50W,提取溫度為 85℃,提取時間 2.5 h,原料粒徑 80目;在此條件下進行 2次重復實驗得出平均提取率為 10.74,重復性較好。王豐俊等［10］針對桑葉多糖的超聲波輔助提取,首先通過單因素試驗選取影響因素與水平,然后在單因素試驗的基礎上采用 4因素 3水平的響應面分析法,依據回歸分析確定了較優(yōu)提取工藝條件,結果表明其較優(yōu)工藝條件:提取溫度 81.5℃,超聲波時間30 min,超聲波功率 100W,水料比 10∶1;采用該工藝條件,桑葉多糖的提取得率達到 2.99%。楊青珍等［11］通過單因素和正交試驗設計,探討了龍桑葉多糖的超聲輔助提取工藝條件,試驗結果表明,龍桑葉多糖的最適提取工藝條件:料液比 1∶40,溫度70℃,水浴時間 2 h,超聲波處理時間 20min;采用該工藝條件,龍桑葉多糖的提取得率超過 1.00%。

1.4 酶輔助法

植物細胞內存在著一定量的蛋白質、纖維素、半纖維素、果膠質等成分,這些物質是胞內多糖等大分子溶出的主要屏障,它們的分解有利于糖類物質的溶出。桑葉多糖酶輔助法提取就是基于此考慮,通過添加胰蛋白酶、纖維素酶或果膠酶等對樣品進行前處理來提高桑葉多糖的得率。

夏平等［12］研究了復合酶法(纖維素酶∶果膠酶 =1∶1)提取桑葉中多糖。通過單因素和正交試驗研究了酶的濃度、酶作用的時間、酶作用的溫度以及酶作用的 pH值對桑葉粗多糖提取率的影響,結果表明:酶輔助法提取的最佳工藝條件為溫度 50℃、pH值 4.5、酶用量 1.0%、提取時間 1 h;提取桑葉多糖的得率可達 14.32%。王芳等［13］研究了超聲波法、酶法和微波法等不同的前處理方法對桑葉多糖提取效率的影響,結果表明:提取桑葉多糖的得率依次為酶輔助法 ＞超聲輔助法 ＞微波輔助法,其中纖維素酶為桑葉多糖的最佳酶提取劑,其酶解的較優(yōu)方案是酶用量為桑葉量的 1.5%,酶解時間 2 h,酶解溫度50℃,酶處理后水提多糖得率可達 12.49%。

1.5 超高壓輔助法

超高壓提取(UHPE)技術是一種全新的天然產物有效成分提取技術,它是在常溫條件下,利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于料液上,保壓一段時間(5 min左右),然后迅速卸壓,進行萃取,達到提取的目的。該技術具有操作簡單、提取率高、時間短、雜質含量少、能耗低以及環(huán)保等優(yōu)點,在功能食品、藥品的加工和開發(fā)應用中具有較大的潛力和價值。

凌慶枝等［14］在單因素試驗的基礎上,采用正交試驗法對桑葉多糖的超高壓提取工藝進行了優(yōu)選。利用L9(34)進行正交試驗,以桑葉多糖的得率為指標,考察了超高壓壓力、保壓時間、pH值和固液比(W∶V)對桑葉多糖得率的影響,結果表明:桑葉多糖的最佳提取工藝條件為超高壓壓力 300 MPa、超高壓處理時間 4.5min、pH值 9.0、固液比 1∶16時,桑葉多糖的提取得率可達 2.23%。同熱浸提取和超聲提取方法相比,超高壓提取方法得率高、提取時間短,是提取桑葉多糖的適宜方法。

2 桑葉黃酮類活性物質提取工藝研究

黃酮類化合物廣泛存在于植物的各個部位,尤其是葉部含量較高,是一種天然抗氧化劑。具有清除人體中超氧離子自由基、抗?jié)?、解痙、抗菌、抗炎、降血脂和鎮(zhèn)痛等生物活性和生理活性作用。桑葉黃酮類物質的提取方法很多,一般多采用柱層析—醇浸提法,或輔以微波法、超聲波法或超高壓法等處理方法來提取分離。

2.1 柱層析—醇浸提法

桑葉黃酮類活性物質的醇浸提法是將桑葉干粉煮沸、過濾,經大孔樹脂吸附,水洗至無色后,用50%～80%質量濃度乙醇或甲醇洗脫,洗脫液低溫濃縮干燥后得桑葉粗黃酮,利用無水乙醇溶解,再經過濾、濃縮、干燥處理等工藝得精制桑葉黃酮類物質。

楊虎等［15］研究了利用乙醇提取桑葉中的黃酮類物質,采用正交實驗考察了回流提取時間、提取次數、乙醇濃度、料液比等因素對提取率的影響,確定了最佳工藝條件:回流提取時間 1.5 h,提取 3次,乙醇濃度 80%,料液比(質量比)1∶30,提取率可達0.723%。張軍等［16］研究了不同單因子對桑葉中黃酮成分浸提效果的影響,試驗結果表明:用 80%乙醇作溶劑,原料質量濃度為 50.00 g/L,于 70℃、pH值 8的條件下浸提 3 h并抽提 2次的提取效果較好,提取得率超過 2.5%。陳月紅等［17］利用 L9(34)正交表優(yōu)選提取條件,通過考察上柱方法、提取方法、粉碎度對桑葉總黃酮得率的影響,探討了桑葉總黃酮的最佳提取工藝,結果表明:80目細桑葉干粉,于 16倍原料的 80%乙醇中,經大孔樹脂柱層析回流提取 2次,每次 1 h時桑葉粗黃酮得率最佳達11%,且穩(wěn)定性良好、簡便易行。

2.2 微波輔助法

李莉［18］研究了以水或 70%乙醇溶劑,微波處理或非微波處理桑葉的各種方法對提取桑葉總黃酮得率的影響,結果表明:桑葉樣品經微波處理10 min,以 70%乙醇作溶劑提取桑葉總黃酮的浸出率最高,達 69.01%。陳菁菁等［19］采用正交試驗設計優(yōu)選出了微波萃取桑葉黃酮的最佳工藝條件,當桑葉樣品于 12倍量 70%乙醇,60℃微波萃取20 min時,桑葉黃酮得率最高,且應用微波萃取法比傳統(tǒng)醇提法桑葉黃酮得率高 55%。胡慶國［20］研究了用微波法提取桑葉中黃酮的工藝條件,探討了微波強度、處理時間、乙醇體積分數、提取溫度和提取時間對桑葉黃酮提取率的影響,結果表明:用 175W微波強度處理 4 min后,以體積分數70%的乙醇,在70℃提取 2 h,得到提取物的黃酮類物質質量濃度比未經微波處理的高出 18.5%。

2.3 超聲波輔助法

高中松等［21］采用醇浸提法、超聲提取法探討了從桑葉中提取總黃酮類物質的最佳工藝,結果表明:通過單因素試驗和正交試驗,超聲提取效果最好,其最佳條件是用濃度為 70%的乙醇,按料液比1∶15的比例浸泡 3 h,再用超聲提取 45m in,其桑葉中總黃酮類物質的提取率可達 2.18%。王麗娟等［22］在優(yōu)化選擇桑葉總黃酮的最佳超聲提取工藝研究中,采用正交實驗法,以提取液中總黃酮含量為考察指標,確定了桑葉總黃酮的最佳超聲提取工藝為用 20倍量 50%乙醇,超聲提取 30min;采用該工藝條件,提取液中總黃酮含量達 2.38%。李宇亮等［23］研究了基于微波破壁處理的超聲提取桑葉中黃酮的工藝,當取料液比為 1∶8,微波破壁 3次,每次 30 s,pH值5.5時,超聲提取 30min(功率 1 800W),黃酮的提取率達到 96.9%,得率為 8.74 mg/g,純度達 95.13%;且該工藝中,微波破壁結合超聲提取與傳統(tǒng)的煎煮法相比較,具有成本低、產物收率高、并可顯著降低提取液中雜質含量等優(yōu)點。

2.4 超高壓輔助法

勵建榮等［24］研究了常溫下超高壓提取桑葉黃酮類化合物蘆丁的提取工藝,觀察了不同提取溶劑、提取壓力、溶劑與原料比、提取時間及桑葉顆粒大小等因素對桑葉蘆丁提取率的影響,并對提取工藝進行了優(yōu)化,結果表明:當以 70%乙醇水溶液為提取溶劑,提取壓力為 500MPa,提取時間為 8 min,桑葉顆粒大小為 0.18～0.25 nm,溶劑與原料比為 20∶1時,桑葉黃酮類化合物蘆丁的提取率可達 23.9mg/g。

3 桑葉生物堿類活性物質提取工藝研究

生物堿也是桑葉的主要活性成分之一。日本學者 Asano等［25］從桑葉中分離出多種多羥基生物堿,其中 DNJ(1-脫氧野尻霉素)在桑葉中含量達0.1l%,且其作為 α-葡萄糖苷酶的抑制劑,具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤轉移等作用;另外,DNJ還是 α-葡萄糖淀粉酶的有效抑制劑,DNJ作為載體,還可用于高純度麥芽糖酶的合成,具有較高的醫(yī)療價值。目前國內外尤其是日本和韓國對桑葉生物堿類活性物質藥理作用的研究較多,但對 DNJ提取工藝的研究相對較少。

李宇亮等［26］研究了從桑葉中提取分離 DNJ,探討了提取劑、提取方法、料液比、提取次數、時間等因素對提取率的影響,實驗表明:提取的最佳條件是以65%的乙醇為提取劑,按料液比 1∶8超聲強化細胞破碎 20 min(功率 1 800 W),732 H陽離子樹脂分離,0.25 mol/L的氨水洗脫(洗脫速度 1～2 mL/min),提取率為 95.8%,純度為 92.3%以上。胡瑞君等［27］利用微波輔助提取技術提取桑葉中生物堿 DNJ,考察了微波功率、微波處理時間、固液比和提取次數等因素對 DNJ得率的影響,確定了最佳提取工藝條件:微波功率為 406W、微波處理時間1.5min、固液比 (g∶m L)為 1∶40、提取次數為 2次 ,提取率超過 80%,提取得率達 0.024%,為以后開發(fā)研制降血糖藥品和保健食品提供了可能,也為桑葉在這方面的進一步開發(fā)利用提供了技術支持。

4 結語

當今科學技術日新月異,先進的提取純化和檢測設備更新換代周期越來越短,促使提取純化工藝和檢測手段更加簡單化、經濟化。隨著提取方法的不斷完善,桑葉功能活性成分在食品、醫(yī)藥中的應用范圍將越來越廣。我國有著豐富的桑葉資源,研究桑葉功能活性成分提取分離技術,開發(fā)桑葉新用途,改善傳統(tǒng)的桑葉利用結構,對于提高桑葉的利用價值,拓寬蠶桑產業(yè)的經濟基礎,保持蠶桑產業(yè)的活力具有重要意義。

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S888.2

B

1007-0982(2011)02-0004-05

2010-12-20;

2011-02-18

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(蠶桑)。

李勇(1980—),男,山東菏澤,碩士,助理研究員。

Tel:027-87106001,E-mail:liyong8057@163.com

胡興明(1963—),男,研究員,碩士生導師。

Tel:027-87380366,E-mail:hxm@hbaas.com