韋亞東 牛淼淼 劉子瑜 車?guó)P玉 張國(guó)政

(1江蘇科技大學(xué),江蘇鎮(zhèn)江 212018; 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,江蘇鎮(zhèn)江 212018)

昆蟲與哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì) N-糖基化修飾異同的比較及其潛在的應(yīng)用意義

韋亞東1,2牛淼淼1劉子瑜1車?guó)P玉1張國(guó)政1,2

(1江蘇科技大學(xué),江蘇鎮(zhèn)江 212018;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,江蘇鎮(zhèn)江 212018)

基于過去多年來所積累的關(guān)于昆蟲蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究成果,對(duì)昆蟲與哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì) N-糖基化修飾途徑與分子機(jī)制的異同進(jìn)行了比較分析,同時(shí)進(jìn)一步討論如何在人們前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)糖基化修飾途徑做些改造性工作,以期能夠直接利用該昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人源化糖蛋白。

昆蟲;哺乳動(dòng)物;桿狀病毒;表達(dá)系統(tǒng);N-糖基化修飾;人源化糖蛋白

自 20世紀(jì) 80年代以來,人們對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了全面的研究并表達(dá)了大量的重組蛋白［1］。該表達(dá)系統(tǒng)包括作為表達(dá)載體的重組病毒和作為病毒繁殖宿主的昆蟲細(xì)胞或蟲體,外源基因的表達(dá)是利用重組病毒非常強(qiáng)的病毒晚期基因啟動(dòng)子,如 polyhedrin或 p10等,協(xié)同病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合體完成的［2］?；谠摫磉_(dá)系統(tǒng)除了能夠以非常高的水平表達(dá)外源基因外,還能夠容納很大的外源基因的插入表達(dá),是一個(gè)很好的表達(dá)多亞基功能蛋白的平臺(tái)［3］。同時(shí),對(duì)人或動(dòng)物具有相對(duì)的生物安全性。因此,人們逐漸把它作為基因治療及應(yīng)用該系統(tǒng)將外源基因引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的重要工具［4］。

在昆蟲桿狀病毒表達(dá)中,當(dāng)病毒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞,宿主自身的基因表達(dá)基本上全面停止,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)轉(zhuǎn)向合成表達(dá)病毒基因,包括插入的外源基因。作為桿狀病毒宿主的昆蟲是真核生物,細(xì)胞能夠以多種復(fù)雜的方式對(duì)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行后修飾,表達(dá)的重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)被折疊、修飾、運(yùn)輸組裝成最終的功能蛋白［5］。其中,N-糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中非常重要的一種,與蛋白質(zhì)的正確折疊、生物半衰期及生物功能正常發(fā)揮息息相關(guān)。目前的研究結(jié)果表明,昆蟲的糖基化修飾和高等動(dòng)物的不同［6］。哺乳動(dòng)物的糖蛋白是具有唾液酸末端的雜合型 N-糖鏈構(gòu)型,而昆蟲細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白糖鏈具有非常簡(jiǎn)單的側(cè)鏈,是低甘露糖型,并且含有對(duì)人類具有過敏反應(yīng)［7］的核心 α-1,3連接的巖藻糖。這些糖鏈結(jié)構(gòu)的差異,極大地限制了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在人類醫(yī)藥上的應(yīng)用。因此,正確認(rèn)識(shí)、分析比較昆蟲與哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì) N-糖基化修飾途徑及其分子機(jī)制的不同,對(duì)改造昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)糖基化修飾途徑,表達(dá)人源化糖蛋白具有非常重要的必要性。本文對(duì)昆蟲與哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì) N-糖基化修飾途徑中的糖鏈修飾的起始、核心糖鏈剪接加工、側(cè)鏈巖藻糖化、核心糖鏈分枝與延長(zhǎng)及其分子機(jī)制異同進(jìn)行比較分析如下。

1 昆蟲和哺乳動(dòng)物糖蛋白的 N-糖鏈修飾的起始及核心糖鏈剪接加工的差異

真核生物的蛋白質(zhì)糖基化修飾過程通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行的。初始階段,事先在一系列酶的作用下組裝好的寡糖復(fù)合前體,轉(zhuǎn)運(yùn)到新生肽的糖基化保守序列的氨基酸上。隨后的初始糖鏈在糖苷酶的作用下進(jìn)行糖鏈的剪切和在糖基轉(zhuǎn)運(yùn)酶作用下的糖鏈加工,形成了一個(gè)小的糖鏈核心結(jié)構(gòu)。在不同的物種中,這個(gè)糖鏈核心結(jié)構(gòu)能夠通過不同的后續(xù)途徑,進(jìn)一步分枝和延長(zhǎng)成最終的成熟糖蛋白的帶有側(cè)鏈的寡糖糖鏈。N-糖鏈修飾的起始及核心糖鏈的形成,在昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的途徑是基本一致和相似的［8］。

研究比較清楚的哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)糖基化過程是起始于寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶的作用。寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一個(gè)多亞基的蛋白酶,它將事先組裝好的 Glc3Man9GlcNAc2寡糖,從寡糖載運(yùn)脂體轉(zhuǎn)運(yùn)至新生肽的糖基化識(shí)別位點(diǎn)(Asn-X-Thr/Ser)上［9］。緊接著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 α-葡萄糖苷酶 I,將最外末端的 α-1,2連接的葡萄糖去除掉［10］。另外的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 α-葡萄糖苷酶 II去除掉第 2個(gè) α-1,3連接的葡萄糖,形成剩有 1個(gè)葡萄糖的核心 GlcMan9Glc-NAc2［11］,這個(gè)酶的后繼作用將最后剩下的 α-1,3連接的葡萄糖從 GlcMan9GlcNAc2上去除掉,形成保守的高甘露糖型的 N-糖鏈構(gòu)型Man9GlcNAc2。這個(gè)結(jié)構(gòu)的糖鏈既可能是某些糖蛋白的最終糖鏈構(gòu)型,也可能是某些糖蛋白糖鏈形成的中間物。

隨后糖鏈 Man9GlcNAc2中甘露糖的剪切加工,是在位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)分屬于 Class I和Class II的 α-甘露糖苷酶作用下進(jìn)行的［12］。α-甘露糖苷酶的協(xié)同作用從 Man9GlcNAc2上去除掉所有 4個(gè) α-1,2甘露糖,最終形成非常重要的中間核心體Man5GlcNAc2。這個(gè)作用過程包括 2個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) α-甘露糖苷酶 I和 α-甘露糖苷酶 II及 3個(gè)高爾基體內(nèi)的 α-甘露糖苷酶 IA、α-甘露糖苷酶 IB及 α-甘露糖苷酶 IC［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng) α-甘露糖苷酶 I是一個(gè)作用比較慢的酶,其只能專一性地去除中間支鏈的末端甘露糖,形成 Man8GlcNAc2異構(gòu)體 B。同樣,內(nèi)質(zhì)網(wǎng) α-甘露糖苷酶 II也只能從 Man9GlcNAc2上去除掉一個(gè)末端的 α-1,3支鏈的甘露糖,最終形成 Man8Glc-NAc2異構(gòu)體 C［14］。緊接著的 3個(gè)α-1,2連接的甘露糖分別被高爾基體 Class I的 3個(gè) α-甘露糖苷酶去除掉,他們分別有自己特殊的底物構(gòu)型偏好。

Man5GlcNAc2是蛋白質(zhì) N-糖基化修飾過程中非常重要的核心糖。在不同物種中,該核心糖在高爾基體的一些糖苷酶作用下,最終形成具有物種特性的高甘露糖構(gòu)型、雜合型或復(fù)合型構(gòu)型［15］。雜合構(gòu)型的 N-糖鏈的末端 α-1,3連接的甘露糖被N-乙酰氨基葡糖代替,但保留 α-1,6連接的甘露糖。復(fù)合構(gòu)型的 N-糖鏈的 2個(gè) α-1,3連接的甘露糖和 α-1,6連接的甘露糖均被 N-乙酰氨基葡糖所代替。

昆蟲的蛋白質(zhì) N-糖基化修飾的起始和哺乳動(dòng)物類似,就是一同將寡糖前體物從 Glc3Man9Glc-NAc2-PP-Dol轉(zhuǎn)移到新生肽鏈的 N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺上［7］。這個(gè)結(jié)論已經(jīng)被昆蟲細(xì)胞中的 N-糖鏈和脂質(zhì)體連在一起所證實(shí)［16］。昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)從 Glc3Man9GlcNAc2去除掉末端的葡萄糖的途徑也是一致的,但昆蟲體內(nèi)編碼 α-葡萄糖苷酶 I和 α-葡萄糖苷酶 II的基因還沒有被克隆出來,不過通過酶抑制劑［17］和 N-糖鏈的分析［18］,能夠證實(shí)鱗翅目昆蟲細(xì)胞存在這 2個(gè)酶的活性。另外,在鱗翅目昆蟲中也已證實(shí)了與甘露糖剪切加工相關(guān)的 α-甘露糖苷酶存在［19］。

2 昆蟲和哺乳動(dòng)物中糖蛋白 N-糖鏈巖藻糖化的異同

昆蟲和哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在核心 α-1,6巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶,這個(gè)酶可以在連接天冬酰胺的 GlcNAcMan3GlcNAc2的 N-乙酰氨基葡糖殘基上,加上 α-1,6連接的巖藻糖。昆蟲的糖基化進(jìn)程隨后在 Class II甘露糖苷酶的剪接加工和核心 α-1,6巖藻糖化后,就與哺乳動(dòng)物徹底不同了［20］。

特殊的是,昆蟲細(xì)胞內(nèi)的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶能夠?qū)⒐餐虚g體 GlcNAcMan3GlcNAc(α1,6Fuc)GlcNAc,修飾成一個(gè)核心 α-1,3巖藻糖化的 N-糖鏈［21］。這個(gè)核心 α-1,3巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶嚴(yán)格需要核心α-1,6巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶的優(yōu)先作用［22］,并且已經(jīng)知道其產(chǎn)物的N-糖鏈對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生過敏反應(yīng)［23］。另一個(gè)重要的不同是有些昆蟲細(xì)胞具有膜錨定的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性,這種酶活性在線蟲［24］和一些植物［25］中也有發(fā)現(xiàn)。它能夠特異地從 GlcNAcMan3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc移除末端的 N-乙酰氨基葡糖殘基［26］。因此,昆蟲的主要 N-糖鏈產(chǎn)物Man3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc一般被叫做低甘露糖構(gòu)型,這些低甘露糖構(gòu)型的N-糖鏈不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。

3 昆蟲和哺乳動(dòng)物糖蛋白的核心糖鏈分枝與延長(zhǎng)

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),Man5GlcNAc2轉(zhuǎn)化為 N-糖鏈的雜合型或復(fù)合型結(jié)構(gòu)是由高爾基 N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶 I(GlcNAc-TI)起始的,它把 1個(gè)N-乙酰氨基葡糖殘基,以 β-1,2鍵轉(zhuǎn)運(yùn)到 α-1,3支鏈的甘露糖上,形成 GlcNAcMan5GlcNAc。這個(gè)中間體可以以很多途徑轉(zhuǎn)化為雜合構(gòu)型,其中 N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶 III(GlcNAc-TIII)就可以在單酶的情況下,將該中間體最終轉(zhuǎn)變?yōu)殡s合型的糖鏈。這個(gè)酶能夠在中間的 β-1,2連接的甘露糖上添加 1個(gè) N-乙酰氨基葡糖,阻斷了隨后的高爾基 α-甘露糖苷酶 II的作用［27］。正常情況下,高爾基 α-甘露糖苷酶 II完成最后的甘露糖修剪作用,去除 GlcNAcMan5GlcNAc2上的 α-1,2和 α-1,6連接的甘露糖殘基,生成中間體GlcNAcMan3GlcNAc2［28］。高爾基 α-甘露糖苷酶II的作用要求必須優(yōu)先在 Man5GLcNAc2的 α-1,3支鏈上,用 GlcNAc-TI加上 1個(gè) N-乙酰氨基葡糖殘基。

在 GlcNAcMan5GlcNAc2的 α-1,3支鏈上,優(yōu)先加上 N-乙酰氨基葡糖,也是 α-1,6海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶形成核心海藻糖化的前體條件,它是轉(zhuǎn)運(yùn) 1個(gè)α-1,6連接的海藻糖殘基到直接和天冬酰胺連接的 N-乙酰氨基葡糖上［29］。所以,海藻糖化的核心 GlcNAc-Man3GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc是通過 N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶 I、高爾基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶協(xié)同作用的結(jié)果。

另 1個(gè)高爾基 N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶 II(Glc-NAc-TII),通過在 GlcNAcMan3GlcNAc(±Fucα1,6)GlcNAc的末端 α-1,6連接的甘露糖上,添加β-1,2連接的 N-乙酰氨基葡糖,形成第 1個(gè)復(fù)合型的糖鏈［27］。高爾基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶一樣,GlcNAc-TII也需要和 GlcNAc-TI一樣的優(yōu)先添加反應(yīng)［30］。GlcNAc-TI和 GlcNAc-TII酶廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中,它們啟動(dòng)了 N-糖鏈的 2個(gè)支鏈的延伸,形成最終的雙天線 N-糖鏈構(gòu)型。另外的支鏈可以由 1個(gè)或多個(gè) N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶啟動(dòng),包括 GlcNAc-TIV、GlcNAc-TV和 GlcNAc-TVI。在這些酶的作用下,最終產(chǎn)生四、五或者六天線的 N-糖鏈,但它們多嚴(yán)格限制在某些組織或惡性腫瘤里。

有末端 N-乙酰氨基葡糖的 N-糖鏈能夠被 1個(gè)或多個(gè)高爾基體 β-1,4半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶(β4GalTs)進(jìn)一步延長(zhǎng),這至少需要 7種人基因編碼的酶和各種特殊的受體底物［31］。其中 β4GalTI到 VI參與糖蛋白或糖脂的生物合成［32］,但 β4GalT-VII僅參與蛋白聚糖的生物合成［31］。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),末端半乳糖化的糖鏈的都加上 α-2,3,α-2,6及 α-2,8連接的唾液酸。人類基因組上編碼多于 20種不同的唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶,其中15種已經(jīng)被克隆和研究［33］。這些唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶都是高爾基體的 II型轉(zhuǎn)膜糖蛋白,具有 3個(gè)一致的 L、S和 VS區(qū)域［34］。不同的唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶作用不同的唾液酸連接鍵,并有不同的特殊受體底物。唾液酸化在很多生物過程中起重要的作用,如神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、糖蛋白及紅細(xì)胞循環(huán)的翻轉(zhuǎn)、病原和宿主的相互作用和免疫系統(tǒng)功能等,它們還和惡性腫瘤的擴(kuò)散及癌變有關(guān)系［35］。從藥物應(yīng)用角度來改造重組糖蛋白時(shí),應(yīng)該考慮到唾液酸化,因?yàn)樗軌蛟诓溉閯?dòng)物細(xì)胞循環(huán)系統(tǒng)里,保護(hù)糖蛋白不被清除。這可以明顯增加糖蛋白藥物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和它的藥物療效［36］。

人們普遍認(rèn)為昆蟲沒有末端糖鏈轉(zhuǎn)運(yùn)酶或者唾液酸代謝機(jī)制［37］,昆蟲的 N-糖鏈形成途徑被認(rèn)為只能限制形成低甘露糖的糖鏈構(gòu)型。但事實(shí)并非如此,現(xiàn)在一些生物化學(xué)的、組織化學(xué)的、結(jié)構(gòu)學(xué)的及分子遺傳學(xué)的證據(jù)表明,至少某些昆蟲具有一些潛在的進(jìn)一步延長(zhǎng)末端唾液酸化糖蛋白的 N-糖鏈的能力。特別是近來果蠅基因組的生物信息學(xué)研究表明,昆蟲具有很多哺乳動(dòng)物 N-糖鏈分枝、延伸及唾液酸化的基因,并且這些基因產(chǎn)物潛在的生物化學(xué)功能已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)［38］,只是這些基因的表達(dá)被嚴(yán)格限制于昆蟲的一些特殊組織和發(fā)育狀態(tài)［15］。

盡管某些昆蟲、昆蟲的某些組織或某些昆蟲細(xì)胞具有潛在的產(chǎn)生哺乳動(dòng)物的復(fù)合型末端唾液酸化的 N-糖鏈的能力,但目前在以 sf21、sf9和 BTI-Tn-5B1-4(High Five)及 Bm細(xì)胞作為宿主使用的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中,表達(dá)的重組 N-糖蛋白的糖鏈?zhǔn)呛?jiǎn)單的、沒有唾液酸化的低甘露糖型,而不是哺乳動(dòng)物在相同糖基化位置產(chǎn)生的唾液酸化的復(fù)合型糖鏈。這使得昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)際上不可能期望能夠生產(chǎn)出具有高等動(dòng)物的 N-糖鏈的糖蛋白,極大地限制了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)哺乳動(dòng)物糖蛋白上的應(yīng)用。

4 目前關(guān)于昆蟲蛋白質(zhì) N-糖基化途徑的觀點(diǎn)

昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)自建立以來,表達(dá)了包括糖蛋白在內(nèi)的大量重組蛋白,提供了很多鱗翅目昆蟲細(xì)胞的 N-糖基化途徑的信息,也間接促進(jìn)了昆蟲蛋白質(zhì)的 N-糖基化途徑的生化和分子遺傳學(xué)的研究。昆蟲基因組項(xiàng)目的完成,尤其是果蠅基因組項(xiàng)目［39］和家蠶基因組項(xiàng)目［40］對(duì)我們理解認(rèn)識(shí)昆蟲蛋白質(zhì)的 N-糖基化途徑具有巨大的促進(jìn)作用。

目前的觀點(diǎn)是,哺乳動(dòng)物和昆蟲蛋白質(zhì)糖基化途徑的前半部分,包括 N-糖鏈的起始轉(zhuǎn)運(yùn)和核心糖鏈的剪切加工是相似或一樣的,都產(chǎn)生一樣的高甘露糖的核心糖鏈。這個(gè)共同的核心糖鏈,一是作為后續(xù)糖基化的中間體,隨后修飾加工成 1個(gè)或 2個(gè)共同的中間產(chǎn)物 GlcNAcMan3GlcNAc［±Fuc］Glc-NAc,進(jìn)入哺乳動(dòng)物和昆蟲不同的后半部分。二是直接作為一些糖蛋白的某些糖基化位點(diǎn)上寡糖鏈的最終產(chǎn)物。在哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞蛋白質(zhì)糖基化的后半部分,N-糖鏈的中間體延伸加工過程及摻入的修飾酶均不同。哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì) N-糖鏈延長(zhǎng)加工成常見的雙天線復(fù)合型結(jié)構(gòu),而昆蟲細(xì)胞的蛋白質(zhì) N-糖鏈為低甘露糖結(jié)構(gòu),含有核心 α-1,3巖藻糖,有時(shí)末端 N-乙酰葡糖胺會(huì)被 GlcNAcase移除。其中產(chǎn)生的核心 α-1,3巖藻糖會(huì)在人體內(nèi)引起過敏反應(yīng)。

實(shí)際上,在昆蟲蛋白質(zhì)的糖基化修飾過程中,最終的 N-糖鏈的形成有時(shí)決定于很多不同的因子。其中一個(gè)明顯的因子就是糖蛋白產(chǎn)物自身的自然屬性,其蛋白質(zhì)本身及其糖鏈加工修飾的一系列產(chǎn)物是否為相應(yīng)糖基修飾酶的較好底物,會(huì)影響和決定隨后的加工途徑及最終糖鏈構(gòu)型。另一方面,編碼這些糖基修飾酶基因的不同表達(dá)水平及其下游調(diào)控作用,也會(huì)明顯地影響蛋白質(zhì) N-糖鏈的最終構(gòu)型。

5 昆蟲蛋白質(zhì) N-糖基化途徑改造

盡管昆蟲自身具有優(yōu)化 N-糖基化進(jìn)程的潛能,使蛋白質(zhì)修飾的糖鏈類似哺乳動(dòng)物,但目前的昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)還不能表達(dá)出具有哺乳動(dòng)物糖鏈構(gòu)型的重組糖蛋白。利用改變昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)液配方組成或改造病毒載體及昆蟲細(xì)胞株,是生產(chǎn)具有哺乳動(dòng)物糖鏈構(gòu)型糖蛋白的可以探索的新研究方向。比較有效可行的方法是利用基因改造的方法,對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞系,進(jìn)行糖基化途徑改造,引入哺乳動(dòng)物的一些相關(guān)糖基修飾酶基因,人為地改變昆蟲的糖基化途徑。技術(shù)層面上,可以通過將相關(guān)糖基修飾酶利用桿狀病毒引入昆蟲宿主細(xì)胞或者直接基因改造昆蟲宿主細(xì)胞,達(dá)到改造昆蟲糖基化修飾途徑的目的,但引入的糖基化修飾基因表達(dá)的時(shí)間非常重要。這要求引入的糖基修飾酶的表達(dá),要比所要表達(dá)的重組糖蛋白在時(shí)間上提前的多,才能保證表達(dá)的目的重組糖蛋白的糖基化按設(shè)計(jì)好的途徑進(jìn)行。

目前一些文獻(xiàn)報(bào)道,用轉(zhuǎn)染和雙篩選方法,將編碼和表達(dá)哺乳動(dòng)物的 β1,4GalT(Sfβ4GalT［41］)、α-2,6sialyltransferase(Sfβ4Gal/ST6［42］和 Tnβ4Gal/ST6［43］)、 GlcNAc-T、 GlcNAc-TII、 β-1,4 GalT、 α-2,6sialyltransferase及 α-2,3sialyltransferase(SfSWT-1［44］)基因插入昆蟲細(xì)胞sf9及 BTI-Tn-5B1-4(High Five)中得到亞細(xì)胞株。這些新細(xì)胞株的生長(zhǎng)特性和它們的母系相似,當(dāng)桿狀病毒感染該細(xì)胞亞株表達(dá)外源糖蛋白時(shí),蛋白質(zhì)上的糖鏈延長(zhǎng)為類似哺乳動(dòng)物的雙天線復(fù)合型末端單唾液酸化的糖鏈結(jié)構(gòu)［44］。

通常昆蟲細(xì)胞系 (如Sf9)不具有 sialyltransferase酶活性的底物 CMP-sialic acid,這種物質(zhì)是糖鏈唾液酸化所必需的［45］。但細(xì)胞亞株 SfSWT-1可以在含有外加唾液酸的培養(yǎng)基中,使表達(dá)的糖蛋白的糖鏈唾液酸化,表明這些昆蟲細(xì)胞具有補(bǔ)償型營(yíng)養(yǎng)途徑［46］。隨后人們將編碼唾液酸合成酶和 CMP-唾液酸合成酶的哺乳動(dòng)物基因,插入 SfSWT-1細(xì)胞內(nèi),得到的 SfSWT-3細(xì)胞株,就能夠在細(xì)胞內(nèi)合成CMP-唾液酸,形成的糖鏈為雙天線、末端單唾液酸化的復(fù)合型 N-糖鏈［47］。

6 小結(jié)和展望

到目前為止,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛地用來表達(dá)各種各樣的重組糖蛋白,對(duì)這些糖蛋白的研究,直接或間接地拓展了我們對(duì)昆蟲系統(tǒng)的N-糖基化途徑的理解。但由于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),不能像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣產(chǎn)生雙天線的復(fù)合型唾液酸化的糖鏈,而使其在應(yīng)用上受到限制。盡管昆蟲細(xì)胞內(nèi)也部分地具有和 N-糖鏈最后修飾相關(guān)的哺乳動(dòng)物同類糖鏈修飾酶的表達(dá),但這些酶被嚴(yán)格地限制于某些昆蟲、昆蟲某些組織類型或某些不知道的環(huán)境因素所控制的某些昆蟲發(fā)育階段。另外,某些昆蟲細(xì)胞株(如 Trichoplusia ni)所表達(dá)的重組糖蛋白糖鏈具有核心 α-1,3連接的巖藻糖,在人體中會(huì)引起過敏反應(yīng)。這些昆蟲非復(fù)合型唾液酸化糖鏈和具有核心 α-1,3連接的巖藻糖修飾都易引起人類過敏反應(yīng),限制了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在醫(yī)藥上的應(yīng)用。需要發(fā)展新的能夠替代的病毒宿主、宿主生長(zhǎng)環(huán)境條件或轉(zhuǎn)基因的病毒宿主等系統(tǒng),其具備產(chǎn)生哺乳動(dòng)物糖鏈的能力。同時(shí),還需要進(jìn)一步將病毒宿主內(nèi)不需要的 GlcNAcase及核心α-1,3連接的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性去除掉。然后,所有的對(duì)該系統(tǒng)改進(jìn)的工作,都需要利用該系統(tǒng)大量表達(dá)重組糖蛋白,分析其糖鏈的變化,來檢測(cè)該系統(tǒng)的糖基化能力。這樣經(jīng)過改造的新的昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng),就能夠用于生產(chǎn)醫(yī)藥應(yīng)用的糖蛋白,尤其是能夠直接用于體內(nèi)治療應(yīng)用的糖蛋白,更好地為人類應(yīng)用。

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S881.2

B

1007-0982(2011)02-0008-06

2010-12-01;

2011-03-03

韋亞東(1969—),男,山東莒南,博士,副研究員。

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