佘尚揚

熒光原位雜交(FISH)是2O世紀8O年代初期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)，Bauman將RNA標記上熒光后作為探針進行DNA檢測［1］。其基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因定位在染色體上。與傳統(tǒng)的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點，不但能顯示中期分裂相，還能顯示間期核。

1 FISH技術(shù)的產(chǎn)生

熒光原位雜交技術(shù)是在同位素原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的.1969年Gall和Pardue及John等分別獨立建立了同位素原位雜交技術(shù)。1974年Evans第一次將染色體顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，提高了基因定位的準確性。1975年，Manning等人最先在溶液的分子雜交中，使用非放射性標記，通過細胞色素C將生物素與RNA分子連接起來。1977年Rudkin等發(fā)明了用間接免疫熒光法檢測目的DNA的非同位素原位雜交技術(shù)。1981年Roumam首次報道了熒光素標記的cDNA作原位雜交。同年，Langer等用生物素標記核苷酸制備探針。1986年，Cremer與Lieher等分別證實了熒光原位雜交(FISH)技術(shù)應(yīng)用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性，從而開辟了間期細胞遺傳學(xué)研究。

2 FISH技術(shù)的發(fā)展

在20世紀90年代，F(xiàn)ISH在方法上逐步形成了從單色向多色、從中期染色體FISH向粗線期染色體FISH再向fiber-FISH的發(fā)展趨勢，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。以下簡單介紹近年來FISH技術(shù)的發(fā)展。

2.1 染色體描繪(chromosome painting) 是用全染色體或區(qū)域特異性探針，通過多彩色FISH使中期細胞特異染色體和間期核呈現(xiàn)不同熒光顏色的條帶，從而分析染色體的方法，常用于識別染色體重組、斷裂點分布、鑒別染色體外核物質(zhì)的起源［2］。

2.2 多彩色原位啟動標記(multicolor primedin situ labeling mulficolorPRINS) 是用寡核苷酸作為引物，原位PCR擴增待測序列，并在此過程中摻入熒光素直接或間接標記的核苷三磷酸，使擴增出的序列都得以標記。通過幾輪這樣的擴增，使待檢的幾個序列的原位擴增產(chǎn)物標記上不同熒光素，實現(xiàn)同時對多個微小缺失和突變等染色體微小改變的檢測。這方法已常規(guī)用于檢測特異性a衛(wèi)星序列在染色體和間期核內(nèi)的定位。

2.3 比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH) 是在熒光原位雜交基礎(chǔ)上結(jié)合消減雜交技術(shù)于9O年代發(fā)展起來的一種新的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)［3］，CGH以不同熒光標記待測和參照細胞群的等量基因組DNA，并用加入一定量的人競爭DNA(Cot-1 DNA)抑制分散重復(fù)序列(interspersed repetitive sequence，IRS)。不同標記的DNA同時與正常中期染色體雜交，結(jié)果正常染色體每個位點上的兩種熒光強度之比反映待測與參照基因組DNA序列的拷貝數(shù)之比。這個方法最大的優(yōu)點是:在一個實驗中完成一個樣本全部染色體丟失和獲得的檢測，并且不需要分裂細胞。主要的缺點是分辨率不高，可以檢出的缺失大小約5～10 Mb;另外，不能檢測出沒有基因組拷貝數(shù)明顯變化的染色體平衡易位、倒位及全基因組的整倍體改變。與FISH相比，CGH在一次實驗中能對腫瘤樣品中整個基因組中的DNA擴增和缺失等變異獲得整體認識，并描繪出相應(yīng)的CGH核型圖［4-5］，可在物種間進行染色體同源性比較，從而彌補了常規(guī)FISH只適于小部分腫瘤的不足。

2.4 在DNA纖維上的熒光原位雜交 游離染色質(zhì)絲盡管已經(jīng)失去了原有的細胞空間結(jié)構(gòu)。但它仍是DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合大分子。其染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)核小體和組蛋白并沒有遭到破壞.在Heng等人的思路的基礎(chǔ)上，Wiegant、Parra和Windle進一步想到用更強的變性劑對染色質(zhì)絲進行處理［6-7］。讓DNA分子完全從蛋白質(zhì)中分離出來，制備出DNA纖維。Wiegant等用一種含高濃度鹽和一定量的變性劑的堿性緩沖液對間期細胞核進行處理后.得到一種被稱為Halo的DNA纖維結(jié)構(gòu)圍繞在細胞核周圍.這是一些環(huán)狀DNA分子片段.通常有400～500kb長，可以用來作為高分辨率的FISH的靶DNA，就是最初的纖維-FISH。纖維-FISH具有高分辨率，能進行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子，靈敏度高等優(yōu)點。由于纖維-FISH的這些優(yōu)點，使得它在染色體圖譜繪制，基因重組研究以及臨床染色體基因序列檢測工作中起著十分重要的作用。

2.5 FISH其他的相關(guān)技術(shù) ring-FISH它利用多聚核苷酸探針，第一次允許檢測質(zhì)粒上的單個基因或基因片段以及單個細胞中的核酸，這種方法的雜交信號特征包含一個像光暈、圓圈形狀的熒光聚集在細胞周邊［8］。

熒光免疫核型分析和間期細胞遺傳學(xué)是一種將免疫核型分析和原位雜交相結(jié)合的方法，這種方法可以同時顯示異種細胞群中單個腫瘤細胞的免疫表現(xiàn)型和一定的基因改變。這種方法和形態(tài)學(xué)有關(guān)，可以對檔藏材料作回顧性研究。其優(yōu)點是診斷快速，可以再現(xiàn)，適合FISH分析前或后沒有所需以前細胞標本的細胞學(xué)樣本。

3 FISH技術(shù)的應(yīng)用

3.1 FISH用于病源微生物診斷 Hogardt［9］等利用FISH技術(shù)直接檢測臨床標本，使用成套設(shè)計的針對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌等痰標本中常見菌的寡核苷酸探針，較傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，可達90%的敏感性和近100%特異性。這提示我們FISH成套探針可用于特定疾病相關(guān)性病原體的檢測。Poppert［10］等用電子顯微鏡、直接熒光染色和FISH檢測感染了沙眼衣原體和肺炎衣原體的HeLa 229細胞，發(fā)現(xiàn)在感染后6 h可用電子顯微鏡觀察到細胞內(nèi)有衣原體形成;FISH在感染后12小時至第6天，均能檢測到衣原體;而直接熒光染色檢測到衣原體時間要晚于FISH。這提示FISH可快速且準確的檢測衣原體感染。而Kapur等［11］則聯(lián)合應(yīng)用PCR和FISH直接檢測泌尿生殖道拭子標本128份，其中FISH的陽性率為21.8%(28/128)，PCR的陽性率為25.7%(33/128)，說明FISH在檢測衣原體感染方面具有高度的特異性和較好的敏感性。

3.2 FISH用于產(chǎn)前診斷 FISH的優(yōu)勢是不僅適用于分裂中期的染色體，也適用于間期核及細胞周期的所有階段。FISH分析無需作細胞培養(yǎng)及顯帶分析，僅做細胞計數(shù);而常規(guī)的細胞遺傳學(xué)檢查，常受分裂相數(shù)量、質(zhì)量、顯帶技術(shù)及個人技能的影響。FISH的突出優(yōu)點是可以快速得出結(jié)果。與歷時7～12 d的傳統(tǒng)染色體顯帶分析相比較，F(xiàn)ISH分析可在24 h內(nèi)完成，讓醫(yī)生盡早做出診斷，制定診療方案。與放射性原位雜交相比較，F(xiàn)ISH技術(shù)無放射性同位素污染，不需要特殊的安全防護，且敏感性與同位素檢測相當。FISH探針特異性在于FISH探針可以有針對性地檢測小的單一序列、著絲粒特異序列和整條染色體，并用已驗證核型分析的推斷和進一步鑒定顯帶法未能確定的標記染色體，對嵌合型的診斷，F(xiàn)ISH比傳統(tǒng)的顯帶法核型分析更可靠［12］。FISH雜交信號明亮，靈敏度高，特異性強，與傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)核型分析的符合率高達99.8%［13］，是一種靈敏準確的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)。

3.3 重復(fù)序列與染色體分帶 基因的染色體定位是FISH技術(shù)在分子生物學(xué)上的重要應(yīng)用。應(yīng)用高分辨FISH結(jié)合CCD相機的計算機圖像分析研究A1u(短散布元件short interspersed element，SINE)和 Ll(長散布元件 long interspersed element，LINE)序列在人中期染色體上的布分，發(fā)現(xiàn)Alu序列主要在R帶，Ll序列主要是O/Q深染帶。FISH技術(shù)與生化、計算機和重組DNA技術(shù)結(jié)合檢測Alu位點。表明DNA序列與帶型有關(guān)。用FISH技術(shù)對人類基因組中編碼基因分布的研究揭示，基因主要集中在染色體上G+C(占金基因組35%)最豐富的DNA區(qū)段。

3.4 端粒序列的定位 FISH可以直接觀察染色體端粒，簡化了對其在核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能究.Werner等用FISH證實在普通小麥等物種中所有缺失染色體的斷裂端都存在端粒序列，認為在小麥中可能存在染色體重新修復(fù)機理，在斷裂端添加端粒序列，而“端粒捕獲”則可以穩(wěn)定染色體的損傷，從而解釋了人類惡性腫瘤中亞端粒易位的高發(fā)生率的原因，這種相互易位最初認為是亞端粒缺失。

3.5 基因圖譜繪制 用FISH可直接檢測DNA在染色體上的位置，由于原位雜交不受位點內(nèi)變異和位點間拷貝數(shù)的影響，F(xiàn)ISH已成為重復(fù)序列和多基因家族作圖的重要手段，它所確定的位置是基因在染色體上實際的物理位置。Ruault等［14］用 FISH將 TRX/MLL基因家族中的 MLL3定位于7q36，這一區(qū)域在骨髓瘤白血病中常常缺失。Shan［15］等用FISH把性反轉(zhuǎn)區(qū)定位于人類染色體9p上。Bryce等［16］用FISH將人調(diào)聚反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄酶基因定位在染色體5p15.33上。采用5一溴脫氧尿嘧啶處理的細胞，可以獲得高分辨顯帶的染色體，從而增加DNA鏈標記到染色體上的分辨能力。如果使用間期細胞，兩個DNA鏈的距離可以縮短至50kb，這個間距是染色體上的分辨距離的1/20［17］，不同探針的次序可以通過測量其間期細胞的距離來確定。

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