池宇朋，鄧梅春，吳遠遠，羅吉，容明強，張亦雅，張東裔，曾雄智，梁宋平

1 湖南師范大學 蛋白質(zhì)化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室，長沙 410081

2 國防科學技術(shù)大學理學院 化學與生物學系生物信息研究中心，長沙 410073

延遲整流鉀通道主要負責動作電位復極化，其中該通道 Kv2.1亞型被發(fā)現(xiàn)在人等幾類物種的β-胰島細胞上廣泛存在，有研究報道顯示 Kv2.1通道在調(diào)節(jié)β-胰島細胞的胰島素分泌上發(fā)揮重要的作用[1-4]。河豚毒素不敏感型鈉通道 Nav1.5亞型是心肌的主要鈉通道并在心肌電活動中發(fā)揮重要作用，許多心臟疾病如長 QT綜合癥、心肌傳導功能障礙等已經(jīng)被證明是 Nav1.5基因突變所致[5]。敬釗毒素-XI (Jingzhaotoxin-XI，JZTX-XI) 是從我國境內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的珍稀蜘蛛敬釗纓毛蛛 Chilobrachys jingzhao[6]粗毒中純化得到的一種新型肽類神經(jīng)毒素。該毒素由34個氨基酸殘基組成，分子中6個半胱氨酸形成 3對二硫鍵。前期的研究結(jié)果顯示JZTX-XI對大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞膜上表達的電壓門控鈉通道和鈣通道均沒有影響，卻對非洲爪蟾卵母細胞上表達的 Kv2.1鉀通道電流和急性分離的大鼠心肌細胞鈉通道電流具有抑制作用，并采用二維核磁共振技術(shù)解析了JZTX-XI的三維溶液結(jié)構(gòu)，根據(jù)該毒素的結(jié)構(gòu)信息推測JZTX-XI的N端第3位的精氨酸殘基可能是負責 JZTX-XI與 Kv2.1通道及Nav1.5通道相互結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基[7]。我們正在研究通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)力爭消除 JZTX-XI對Nav1.5通道的抑制活性，從而正在把JZTX-XI改造成為一個高效特異性的 Kv2.1通道亞型抑制劑，實現(xiàn)將該毒素開發(fā)成治療2型糖尿病藥物的潛在醫(yī)用價值。為了深入研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，本文用固相多肽合成的方法合成了天然JZTX-XI及其突變體R3A-JZTX-XI，并探索合成產(chǎn)物的氧化復性條件，結(jié)合電生理膜片鉗技術(shù)研究合成毒素對 HEK293T細胞上瞬時轉(zhuǎn)染表達的鉀通道亞型 Kv2.1和鈉通道亞型Nav1.5電流的抑制作用，為下一步通過蛋白質(zhì)工程將JZTX-XI改造成一個高效特異性的Kv2.1通道亞型或Nav1.5通道亞型的抑制劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

9-芴甲氧羰基 (Fmoc) 氨基酸、N-甲基嗎啡啉(NMM)、哌啶 (Piperidine) 購自吉爾生化 (上海) 有限公司；Rink Resin樹脂購自天津南開和成公司；還原型谷胱甘肽 (GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCL)、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2’-乙磺酸 (HEPES)、乙二醇雙 (2-氨基乙基) 四乙酸(EGTA)、N-甲基-D-葡萄糖胺 (NMG)、二巰基乙烷、苯甲硫醚、三氟乙酸 (TFA)、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA) 等購自Sigma公司；二甲基甲酰氨 (DMF) 購自美國Tedia公司；3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HCTU) 購自上海正極生物科技有限公司；乙腈、甲醇均購自湖南化工研究院。HEK293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究生院生物化學與細胞生物學研究所，SCN5A-pCDNA3.1[8]和hK2.1[9]通道質(zhì)粒分別由美國哥倫比亞大學Robert S. Kass教授和英國倫敦大學藥學院的Martin Stocker教授提供。

1.2 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的化學合成與分離純化

采用Fmoc-氨基酸和HCTU偶聯(lián)的固相多肽化學合成方法[10]，在PS3 多肽合成儀上進行多肽的固相化學合成。多肽粗品利用半制備型的反相 HPLC進行分離純化 (反相柱：10 mm×250 mm Phenomenex C18 column；洗脫液A：含0.1% TFA的水溶液；洗脫液B：含0.1% TFA 的乙腈，洗脫梯度為20 min內(nèi)B液的濃度變化為25%~35%；流速是3.0 mL/min)，利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析各峰的質(zhì)荷比，以確定目的峰的位置，然后收集目的峰真空冷凍干燥。再選取目的峰再用分析型的反相HPLC (Waters Alliance) 進行分離純化 (反相柱：Waters 4.6 mm×250 mm C18 column；洗脫梯度同上，流速為1.0 mL/min)，通過上述2次分離純化確保合成產(chǎn)品純度達到95%以上，然后凍干備用。

1.3 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的氧化還原復性

參照文獻[10]的方法，每次各取0.1 mg純化的合成的JZTX-XI粗樣在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、一定比例濃度的 GSH/GSSG、不同pH值的緩沖液中進行氧化復性。對于每個復性條件都在不同的時間間隔取出100 μL反應液，加10 μL 50% TFA水溶液終止反應后，用分析型反相HPLC進行氧化復性的實時監(jiān)測 (反相柱：Waters 4.6 mm×250 mm C18 column，洗脫液A：含0.1% TFA 的水溶液；洗脫液B：含0.1% TFA的乙腈，洗脫梯度為20 min內(nèi)B液的濃度變化為25%~35%，流速為1.0 mL/min)，對收集洗脫峰進行質(zhì)譜分析來確定合適的復性時間和pH值。根據(jù)實驗結(jié)果，再采用最優(yōu)條件對天然毒素和突變體R3A-JZTX-XI進行氧化復性。

1.4 氧化復性產(chǎn)物與天然JZTX-XI共洗脫實驗

將氧化復性JZTX-XI與天然JZTX-XI等量混合后，在反相HPLC (Waters Alliance) 上進行共洗脫實驗 (色譜條件同1.3)。

1.5 人胚腎細胞 (Human embryonic kidney 293T，HEK293T) 的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞的培養(yǎng)按照標準的組織培養(yǎng)條件 (37 ℃、5% CO2、15%的相對濕度)，在培養(yǎng)箱中用含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。Nav1.5和K2.1通道質(zhì)粒與HEK293T細胞的瞬時轉(zhuǎn)染是采用美國Invitrogen公司的脂質(zhì)體2000按照用戶使用手冊進行。先將Nav1.5或K2.1通道質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000和綠色熒光蛋白GFP報告質(zhì)粒復合物滴加進入盛有HEK293T細胞的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后孵育4~6 h，再換新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)。瞬時轉(zhuǎn)染后24~72 h內(nèi)均可挑選顯示綠色熒光的細胞進行膜片鉗實驗[11]。

1.6 瞬時表達于 HEK293T細胞的 hKv2.1和hNav1.5通道電流的記錄

室溫 (25±1) ℃下采用全細胞膜片鉗技術(shù)進行實驗。電流記錄利用 EPC9放大器 (HEKA公司，German) 在電腦上進行，記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件。玻璃管為 100 μL (VWR micropipettes，VWR Company) 的硼硅酸鹽玻璃毛細管。玻璃電極經(jīng)兩步拉制而成，充灌電極液后電極電阻一般為 2~3 M?。測定鈉電流的細胞外液為(mmol/L)：NaCl 140、KCl 3、MgCl21、CaCl21和HEPES 10，調(diào)pH值為7.3；細胞內(nèi)液為 (mmol/L)：CsF 140、EGTA 1、NaCl 10和HEPES 10，pH 7.3。測定鉀通道電流的細胞外液為 (mmol/L)：Choline chloride 130、D-glucose 12、MgCl22、CaCl22和HEPES 10，pH 7.2。細胞內(nèi)液為 (mmol/L)：KF 120、NMG 20、HEPES 10、EGTA 10、MgATP 2和Li2GTP 0.5，pH 7.2。細胞外液和細胞內(nèi)液均用0.22 μm濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 JZTX-XI與R3A-JZTX-XI的固相化學合成

合成的 JZTX-XI粗品經(jīng)真空冷凍干燥后為白色粉末，采用RP-HPLC分離純化2次，收集洗脫峰經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，其中保留時間為15.1 min的單一峰相對分子量 (MH+) 為3 734.041 (圖1A)，與JZTX-XI (線性) 理論分子量3 733.358相符；保留時間為 17.0 min的單一峰相對分子量(MH+) 為3 649.012 (圖1B)，與R3A-JZTX-XI (線性) 理論分子量3 648.250相符，提示固相多肽合成是成功的。

圖1 JZTX-XI和R3A-JZTX-XI的合成RP-HPLC分析圖Fig. 1 Identification of synthetic JZTX-XI and R3A-JZTX-XI by RP-HPLC. (A) JZTX-XI. (B) R3A-JZTX-XI. The synthetic JZTX-XI and R3A-JZTX-XI were applied to a phenonmenex C18 column (10 mm×250 mm) pre-equilibrated with 0.1% TFA. Elution was performed with a linear gradient of 25%?35% acetonitrile over 20 min at a flow rate 3.0 mL/min at 40 °C. Asterisks indicated the fractions of interest.

2.2 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的氧化還原復性

化學合成的多肽由于是線性分子，沒有生物學活性，所以檢測活性前需要進行氧化復性，使其形成正確的空間結(jié)構(gòu)和二硫鍵配對，但氧化還原復性的過程常受多種因素的影響。因此在大量合成多肽進行復性前，需要探索其最佳氧化復性條件。根據(jù)實驗室以往的復性研究結(jié)果，確定樣品濃度為0.05 g/L較好，然后比較采用不同比例濃度的谷胱甘肽組合GSH/GSSG (5 mmol/L∶0.5 mmol/L，2 mmol/L∶0.2 mmol/L，1.0 mmol/L∶0.1 mmol/L)和不同pH值 (7.0、7.5、8.0) 緩沖溶液條件下復性產(chǎn)物峰面積的大小，從而確認JZTX-XI的最佳氧化復性條件為：含 1.0 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、pH為8.0、濃度為0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液，樣品質(zhì)量濃度為0.05 g/L，復性溫度為4 ℃。圖 2A展示了線性 JZTX-XI氧化復性動態(tài)變化情況。隨著復性時間的延長，復性目的峰形逐漸變大，峰面積逐漸增加。當復性進行至12 h以后，峰形在48 h之內(nèi)都能夠保持相對穩(wěn)定，單一主峰明顯，提示該毒素分子的復性在12 h內(nèi)已經(jīng)基本完成。復性產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，相對分子質(zhì)量為3 726.115 (圖3A)，比線性JZTX-XI的分子質(zhì)量減少了6，提示復性后的JZTX-XI形成了3對二硫鍵。將復性產(chǎn)物與天然JZTX-XI等量混合后進行共洗脫實驗只得到單一峰 (圖2B)，推斷復性產(chǎn)物的二硫鍵配對方式正確，合成毒素與天然毒素在結(jié)構(gòu)上具有一致性。突變體R3A-JZTX-XI的合成、分離和復性方法均同上。復性產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，其相對分子質(zhì)量為3 642.617 (圖3B)，形成了3對二硫鍵，與預期一致。

圖2 JZTX-XI的反相色譜圖Fig. 2 RP-HPLC chromatograms of sJZTX-XI. (A) HPLC chromatograms in refolding process of synthetic JZTX-XI. (B) HPLC chromatogram of co-injected native and refolded JZTX-XI in refolding process.

圖3 sJZTX-XI和R3A-JZTX-XI復性產(chǎn)物的質(zhì)譜圖譜Fig. 3 Mass spectra of refolded sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI. (A) sJZTX-XI. (B) R3A-JZTX-XI.

2.3 JZTX-XI和 R3A-JZTX-XI對瞬時表達于HEK293T細胞的hNav1.5鈉通道活性的影響

前期的研究顯示JZTX-XI可以抑制大鼠心肌細胞上的鈉通道電流，其Kd為0.74 μmol/L[7]。然而，JZTX-XI對電壓門控鈉通道亞型的作用卻還不清楚。本文運用全細胞膜片鉗技術(shù)研究了JZTX-XI對瞬時表達于HEK293T細胞的鈉通道亞型hNav1.5的影響。電流去極化誘導方式：細胞膜電位鉗制?80 mV，以50 ms的時程給予一測試電壓?10 mV，每隔 5 s重復 1次。膜片鉗電生理實驗表明，1.0 μmol/L的天然 JZTX-XI (nJZTX-XI) 和合成JZTX-XI (sJZTX-XI) 分別能抑制 (70.4±3.1)% (圖4A，n=5) 與 (67.5±4.2)% (圖4B，n=5) 的hNav1.5通道電流，表明合成 JZTX-XI與天然 JZTX-XI對hNav1.5通道電流的抑制作用的大小非常接近，進一步證實合成JZTX-XI與天然JZTX-XI在結(jié)構(gòu)與活性性上具有一致性。同時實驗結(jié)果表明合成JZTX-XI對 hNav1.5通道的抑制作用具有明顯的濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度 (IC50) 為437.12 nmol/L。然而1.0 μmol/L的合成突變體R3A-JZTX-XI卻只能抑制同樣轉(zhuǎn)染表達的鈉通道 hNav1.5電流的(35.7±4.1)% (圖 4C，n=4)，其半數(shù)有效抑制濃度(IC50) 為1.96 μmol/L (圖4D)。比較上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體 R3A-JZTX-XI對鈉通道亞型 hNav1.5的抑制活性比天然nJZTX-XI降低了約4.5倍，表明JZTX-XI分子中第3位的精氨酸殘基是與Nav1.5通道結(jié)合活性相關(guān)的氨基酸殘基。

圖4 JZTX-XI與突變體R3A-JZTX-XI對表達于HEK293T細胞hNav1.5通道電流的抑制作用Fig. 4 Effects of nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI on hNav1.5 channel currents expressed in HEK293T cells. Nav1.5 currents traces were evoked by a 50 ms depolarization to ?10 mV from a holding potential of ?80 mV. Every data point (±s) came from 3?5 separated experimental cells. A, B and C showed that 1.0 μmol/L nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI could inhibit hNav1.5 channel currents expressed in HEK293T cells, and they reduced Nav1.5 currents by (70.4±3.1)% (n=5), (67.5±4.2)% (n=5) and (35.7±4.1)% (n=4), respectively. D showed that the IC50 values of sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI were 437.12 nmol/L and 1.96 μmol/L, respectively.

2.4 JZTX-XI和 R3A-JZTX-XI對瞬時表達于HEK293T細胞的hKv2.1通道活性的影響

進一步研究了天然 JZTX-XI及其突變體R3A-JZTX-XI對瞬時表達于HEK293T細胞上的電壓門控鉀通道亞型hKv2.1的抑制作用。電流去極化誘導方式：細胞膜電位鉗制?80 mV，以300 ms的時程給予一測試電壓+30 mV，每隔 5 s重復 1次。膜片鉗實驗表明，100 nmol/L天然 JZTX-XI (nJZTX-XI)、合成 JZTX-XI (sJZTX-XI) 和突變體R3A-JZTX-XI對hKv2.1鉀通道電流的抑制程度分別為 (53.9±7.8)% (圖 5A，n=5)、(51.2±5.4)% (圖5B，n=5) 和 (5.7±3.1)% (圖 5C，n=4)。如圖 5D所示，sJZTX-XI和R3A-JZTX-XI對hKv2.1鉀電流的抑制作用隨濃度的增大而增強，具有明顯的濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度 (IC50) 分別為95.8 nmol/L和1.22 μmol/L。比較上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體R3A-JZTX-XI對hKv2.1鉀通道的抑制活性比天然JZTX-XI降低了約12.4倍，說明第3位的精氨酸殘基是負責JZTX-XI與Kv2.1通道結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基。

圖5 JZTX-XI與突變體R3A-JZTX-XI對表達于HEK293T細胞hKv2.1通道電流的抑制作用Fig. 5 Effects of nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI on hKv2.1 channel currents expressed in HEK293T cells. hKv2.1 currents traces were evoked by a 300 ms depolarization to +30 mV from a holding potential of -80 mV. Every data point (±s) came from 3?5 separated experimental cells. A, B and C showed that 100 nmol/L nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI could inhibit hKv2.1 channels currents expressed in HEK293T cells, and they reduced hKv2.1 currents by (53.9±7.8)% (n=5), (51.2±5.4)% (n=5) and (5.7±3.1)% (n=4), respectively. D showed that the IC50 values of sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI were 95.8 nmol/L and 1.22 μmol/L, respectively.

3 討論

Kv2.1鉀離子通道是一種延遲整流型鉀通道，廣泛分布于胰島β細胞、大腦海馬和皮層神經(jīng)元細胞上，在調(diào)控胰島素分泌和腦缺血介導的細胞損傷過程中發(fā)揮一定作用[12-13]，但目前人們對于 Kv2.1通道在細胞生命活動過程中具體功能依然不是十分清楚，而蜘蛛毒素中存在的 Kv2.1通道抑制劑為該研究提供了合適的藥理學工具，如著名的蜘蛛毒素Hanatoxin1就是一種常用的研究 Kv2.1通道的工具試劑，但是該毒素因為其復性產(chǎn)率太低很難通過合成的方法大量獲得該毒素而限制了其應用[14]。另外一個Kv2.1鉀離子通道抑制毒素是SGTx1，該毒素可以化學合成，通過丙氨酸掃描突變研究確定了其與 Kv2.1通道發(fā)生作用的關(guān)鍵活性殘基[15]。目前Hanatoxin1、SGTx1和JZTX-XI的三維溶液結(jié)構(gòu)都已經(jīng)得到解析，單從氨基酸序列上看這 3個毒素第3位都是精氨酸殘基，而且已有研究顯示SGTx1第3位的精氨酸殘基是一個關(guān)鍵氨基酸殘基。本文成功合成了野生型 JZTX-XI和該毒素的突變體R3A-JZTX-XI，通過高效液相色譜與生物質(zhì)譜分析顯示合成產(chǎn)物能夠較好的折疊復性并形成 3對二硫鍵。電生理實驗結(jié)果顯示突變體R3A-JZTX-XI對瞬時表達于HEK293T細胞的鉀通道hKv2.1電流的抑制活性比野生型毒素降低了約 12.4倍，說明 Arg3是負責 JZTX-XI與hKv2.1通道結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基，進一步通過三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) Hanatoxin1、SGTx1和JZTX-XI毒素第3位的精氨酸殘在空間結(jié)構(gòu)上具有保守性，提示這3個毒素分子在hKv2.1通道上可能具有相同的結(jié)合位點。

Nav1.5通道是一種河豚毒素不敏感型鈉離子通道，主要分布于心肌細胞上，近年來也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細胞瘤細胞和腦組織中高度表達。已有的研究結(jié)果表明一些心血管、腫瘤和癲癇等疾病的發(fā)生也與Nav1.5通道有關(guān)[5]。敬釗纓毛蛛毒素-III (JZTX-III)是已經(jīng)報道過的心肌細胞鈉通道抑制劑，其半數(shù)有效抑制濃度為380 nmol/L[16]，但是該毒素第3位是谷氨酸殘基，JZTX-XI與JZTX-III在 Nav1.5通道上是否有相同的作用位點還有待進一步研究證明。

總之，敬釗毒素-XI是一種新型Kv2.1和Nav1.5交叉通道活性抑制劑，開展其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究可以為深入闡明該毒素與通道相互作用的分子機制提供實驗依據(jù)，并為將來通過蛋白質(zhì)工程手段移除該毒素Nav1.5通道的相關(guān)活性，使其改造成為研究胰臟鉀通道 Kv2.1的分子探針，設計開發(fā)以 Kv2.1通道為靶點相關(guān)的藥物研究提供新的思路。

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