李麗妍，管華詩，江曉路，郝劍君

1 中國海洋大學醫(yī)藥學院，青島 266003

2 中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003

海藻工具酶
——褐藻膠裂解酶研究進展

李麗妍1，管華詩1，江曉路2，郝劍君2

1 中國海洋大學醫(yī)藥學院，青島 266003

2 中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003

從海洋生物中篩選提取有價值的酶類，開發(fā)海洋多糖降解產(chǎn)物，已成為海洋生物資源開發(fā)的一個重要方面。因此，近年來對于海藻工具酶之一的褐藻膠裂解酶及其降解產(chǎn)物——褐藻寡糖的研究日益受到人們的普遍關注。從褐藻膠裂解酶的來源、分類、底物專一性、作用方式及結(jié)構(gòu)與機理研究、酶活力測定和酶學性質(zhì)等方面，結(jié)合本課題組的研究工作綜述近十年來有關褐藻膠裂解酶的研究進展。

褐藻膠，褐藻膠裂解酶，聚甘露糖醛酸，聚古洛糖醛酸，寡糖

1 褐藻膠裂解酶的分類

褐藻膠裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC (Enzyme classification) 數(shù)據(jù)庫中被分為多聚α-L-1,4-古洛糖醛酸裂解酶 (EC 4.2.2.11) 和多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶 (EC 4.2.2.3)。它們分別以β消除方式作用于含有古洛糖和甘露糖的 C-O糖苷鍵，形成在非還原端 C4,5間具有不飽和雙鍵的4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid結(jié)構(gòu)，該寡糖在230~240 nm下有強烈的吸收峰[2]。

為了更加詳細地描述酶的分類地位，CAZy (Carbohydrate-active enzymes) 數(shù)據(jù)庫將EC4.2.2的酶根據(jù)其初級結(jié)構(gòu)不同細化為 22個多糖裂解酶(Polysaccharide lyase，PL) 家族，按照酶的氨基酸序列相似性加以分類，以反映各個酶的結(jié)構(gòu)特征。褐藻膠裂解酶被劃分在PL-5、PL-7和PL-15家族中，其中大多數(shù)的褐藻膠裂解酶被列于 PL-5和PL-7中。PL-5屬α/α barrel結(jié)構(gòu)，目前共有40個酶；PL-7屬β-jelly roll結(jié)構(gòu)，共84個酶，其中82個酶來自細菌，2個酶來自真核生物；個別的褐藻膠裂解酶被列于 PL-15家族，例如來自鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. A1的alginate lyase A1-Ⅳ和重組酶A1-Ⅳ’，而alginate lyase A1-Ⅰ、A1-Ⅱ?qū)儆赑L-7家族，A1-Ⅲ屬于PL-5家族[3]。大多數(shù)PL-5和PL-7家族的褐藻膠裂解酶分別降解 pM (Polymannuronic acid) 和 pG (Polyguluronic acid) 片段，而對于PL-15，則兩種情況均存在[4]。

按其分子量大小不同也可將褐藻膠裂解酶分為3類[3]：第1類分子量在20~35 kDa之間(Mr 30 000類)，第2類分子量約為40 kDa (Mr 40 000類)，第3類分子量約60 kDa (Mr 60 000類)。

2 褐藻膠裂解酶的來源

褐藻膠裂解酶主要來源于海洋藻類、海洋軟體動物、棘皮動物等體內(nèi)和多種微生物 (包括海洋細菌、陸生真菌和極少數(shù)的病毒)，其中細菌類是褐藻膠裂解酶研究最為廣泛的來源，如假單胞菌(Pseudomonas sp. QD03[5]、Pseudomonas sp. F6[6]、Pseudomonas fluorescens[7]、Pseudomonas aeruginose CF1/M1[8]、Pseudomonas sp. Os-ALG-9[9]、Pseudomonas syringae[10])、弧菌 Vibrio sp. O2[11]、固氮菌Azotobacter vinelandii[12]、克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae[13]、黃桿菌Flavobacterium sp. LXA[14]、棒桿菌 Corynebacterium sp. ALY-1[15]、芽胞桿菌Bacillus sp. ATB-1015[16]、類單胞菌Alteromonas sp. No. 272[17]、交替假單胞菌 (Pseudoaltermonas elyakovii[18]，Pseudoalteromonas sp. CY24[19])、腸桿菌 Enterobacter-Cloacae M-1[20]、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. strain A1[3]、鏈霉菌 (Streptomyces sp. A5[21]，Streptomyces sp. ALG-5[22]) 和Agarivorans sp. JAM-Alm[23]等。

在海洋軟體動物和棘皮動物體內(nèi)也存在褐藻膠裂解酶。2009年，Hata等[24]對分離自一些腹足類軟體動物肝胰腺的褐藻膠裂解酶的基本性質(zhì)進行了比較研究，分離自古腹足目Archeogastropoda的皺紋盤鮑 Haliotis discus hannai、紐西蘭鮑螺 H. iris和粗瘤黑鐘螺Omphalius rusticus的單一酶的分子量分別為28、34、34 kDa，而分離自中腹足目的濱螺L. brevicula的3個酶分子量分別為35、32、 28 kDa。這些酶依據(jù)其底物特異性被確認為polyM裂解酶 (EC 4.2.2.3)。Suda等[25]1999年在小球藻病毒 Chlorella virvus中也發(fā)現(xiàn)了褐藻膠裂解酶的基因。

3 底物專一性

褐藻膠是由α-L-古洛糖醛酸和它的異構(gòu)體β-D-甘露糖醛酸以1,4糖苷鍵連接成的線性多糖，包括3種可能的排列方式：多聚古洛糖醛酸 (poly-α 1，4-L-guluronate，pG)、多聚甘露糖醛酸 (poly-β1，4-D-mannuronate，pM) 和不規(guī)則雜合片段pMG。褐藻膠的結(jié)構(gòu)組成、褐藻膠裂解酶的作用方式和作用位點見圖1。依據(jù)褐藻膠裂解酶在褐藻膠pM或pG處的斷裂方式不同分為pM裂解酶和pG裂解酶。褐藻膠裂合酶底物專一性包括pG、pM和pMG。褐藻膠的來源通常影響它們的特異性。來自軟體動物的褐藻膠裂合酶和來自幾種海洋細菌的細胞結(jié)合的褐藻膠裂合酶具有 pM底物特異性，而那些發(fā)現(xiàn)于細菌培養(yǎng)液的胞外酶則具有pG底物特異性。底物特異性與裂解酶產(chǎn)生菌的來源環(huán)境有關，或者可以追溯到褐藻膠的種類，例如能降解細菌來源的褐藻膠多為pM特異性。大多數(shù)的裂解酶均具有內(nèi)切酶活性，但有一些酶是外切酶，從多糖的末端切除單體或二聚體寡糖，如來自Sphingomonas sp. A1的A1-IV[4]。

圖1 褐藻膠裂解酶酶切位點及作用方式示意圖Fig. 1 Profile of degradation position and mode of action of alginate lyase on alginate acid. The place hollow arrow showed the degradation position of exo-alginate lyase. The places solid arrows showed the degradation positions of endo-alginate lyase on pM, pMG and pG, respectively.

4 褐藻膠裂解酶作用方式及機理

褐藻膠裂解酶以β-消除方式催化降解褐藻膠，在C4,5之間形成不飽和雙鍵，并產(chǎn)生一個非還原末端 為 4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid的結(jié)構(gòu)。Gacesa[26]假設了褐藻膠裂解酶的催化機理為3步反應，包括：(a) 由鹽橋中和以移除羧基離子上的負電荷；(b) 吸引 C5位上的質(zhì)子；(c) 電子從羧基基團上轉(zhuǎn)移并在C4,5之間形成雙鍵，導致4-O-糖苷鍵的β消除反應。

在研究眾多的褐藻膠裂解酶中，有關其降解機制研究最為全面和深入的是鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. A1產(chǎn)褐藻膠裂解酶。1993年，Yonemoto等[27]首次報道了菌株Sphingomonas sp. A1產(chǎn)來自同一前體蛋白經(jīng)翻譯后自動加工的 3種褐藻膠裂解酶A1-Ⅰ(66 kDa)、A1-Ⅱ(25 kDa) 和A1-Ⅲ(40 kDa)。1998年Hashimoto等[28]確定A1-Ⅲ為內(nèi)切酶，對 pM和雜合的褐藻膠片段區(qū)域有降解能力，作用于四糖，產(chǎn)生二糖和三糖，并于次年得到該酶的晶體結(jié)構(gòu)[29]。A1-Ⅱ具有pG特異性，并釋放三糖和四糖，A1-Ⅰ具有pM和pG特異性，產(chǎn)生二糖和三糖產(chǎn)物。2003年 Miyake等[30]在研究褐藻膠裂解酶降解褐藻膠機理的過程中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)自該菌的寡糖裂解酶 (A1-Ⅳ) (85 kDa) 及其基因，該酶在前3種酶將褐藻膠降解為二糖和三糖片段后，以外切形式將寡糖徹底切割為單糖，因此在褐藻膠的徹底降解過程中扮演了重要的角色。該酶基因位于編碼前 3種內(nèi)切酶的前體蛋白基因和ABC載體基因的下游，編碼A1-Ⅰ、A1-Ⅱ和A1-Ⅲ共同前體蛋白的基因，編碼 A1-Ⅳ酶的基因及載體基因形成了基因簇。為了確定酶催化反應的關鍵氨基酸，2001年Yoon等[31]對 A1-Ⅲ酶的 His殘基進行定點突變研究，證實His192確為活性中心的關鍵氨基酸之一。2005年A1-Ⅳ與其同源蛋白 A1-Ⅳ’ (90 kDa) 均被劃分在PL15家族中[32]。同年，Yamasaki等[33]得到了A1-Ⅱ和重組酶A1-Ⅱ’的晶體結(jié)構(gòu)。2008年，Ogura等[34]報道了A1-Ⅱ’經(jīng)定點突變和晶體結(jié)構(gòu)分析等推斷的該酶的催化中心，確定了His191、Tyr284和Gln189為活性中心關鍵氨基酸并推斷它們在催化中的作用方式。該研究小組主要對該菌所產(chǎn)褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)和降解過程進行了研究，通過酶或酶與底物復合物的晶體結(jié)構(gòu)的研究理解褐藻膠裂解酶的作用方式。迄今為止已獲得褐藻膠裂解酶A1-Ⅱ、A1-Ⅱ’、A1-Ⅲ和 A1-Ⅳ’的十幾種單體和復合物的晶體結(jié)構(gòu)并保存在Protein Data Bank (PDB) 中。

5 褐藻膠裂解酶酶活的測定方法

目前，褐藻膠裂解酶的酶活力測定方法主要有：硫代巴士酸法 (Thiobarbituric acid assay)[35]、紫外吸收法 (Ultroviolet absorption assay)[35]、粘度法(Viscometry assay)[36]和還原糖法 (Reducing sugar assay)[35,37]。硫代巴比妥酸法 (Thiobarbituric acid assay，TBA) 是基于酶解產(chǎn)生的不飽和糖醛酸可以和高碘酸反應生成 β-甲酰丙酮酸，此中間產(chǎn)物再與硫代巴比妥酸反應的陽性產(chǎn)物可以在 548 nm下比色定量。紫外吸收法是基于酶解產(chǎn)生的不飽和糖醛酸在230~240 nm處有較高的吸收峰，這種方法比較靈敏，是目前褐藻膠裂解酶酶活測定的主要方法。粘度法的應用是由于褐藻酸、瓊膠等多糖的膠體性質(zhì)，通過粘度計測定其流體的運動性能的變化判斷酶解程度，但這種方法可重復性差，操作繁瑣。常用的還原糖法包括DNS法和Nelson-Somogyi法。DNS試劑 (3,5-二硝基水楊酸) 與含有自由醛基和酮基的還原糖共熱反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，在520 nm波長處有最大光吸收，利用比色法測定其還原糖的生成量就可測定酶的活力。而 Nelson-Somogyi法是指酶解產(chǎn)生的還原性寡糖在堿性溶液中將銅試劑中的二價銅離子還原成一價銅離子，中間產(chǎn)物氧化亞銅可與砷鉬酸試劑生成藍色的砷鉬藍溶液，該溶液在一定波長下的吸光值與還原糖的濃度成正相關，從而確定酶的活力。

6 褐藻膠裂解酶的酶學性質(zhì)及酶系

近年來多種細菌來源的褐藻膠裂解酶[3,5,6,8-10,13,17-18,20,22-24,36,38-47]得到提純并對其酶學性質(zhì)進行了研究，現(xiàn)按照分子量、最適溫度、最適pH值、等電點和底物特異性等列于表1中。由表可知，按照分子量劃分褐藻膠裂解酶的方法，第1類酶多表現(xiàn)為pG裂解特異性，第3類酶則表現(xiàn)出pM裂解特異性或具有多種底物專一性。

本研究小組從海藻中篩選到一株褐藻膠降解菌，經(jīng)生理生化和分子水平鑒定，該菌株被命名為熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens HZJ216。分離純化得到 3種褐藻膠裂解酶，其部分酶學性質(zhì)列于表1中。金屬離子Na+、K+、Mg2+等均對3種酶的活力有促進作用，F(xiàn)e2+、Fe3+、Ba2+和Zn2+等離子則顯示不同程度的抑制作用。經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵液酶活可達1 120 U/mg (紫外吸收法)，是制備褐藻膠裂解酶制劑比較理想的候選酶。

職業(yè)技術(shù)競賽是體現(xiàn)學生能力的重要途徑，也是體現(xiàn)教學效果的重要方式。環(huán)境類專業(yè)學生擬參加全國職業(yè)技術(shù)大賽，須進行第一輪的理論考試、第二輪的實操考核、第三輪的小組選拔和第四輪的心理測試，最終選定2名參賽選手進行重點培育和2名備選選手跟蹤培養(yǎng)，參賽選手的選拔過程見圖1。這種選拔方式雖然能夠體現(xiàn)強者更強的用人思路，但卻忽略了教育的普惠性[6]。為此，在設置專業(yè)實訓上，以參賽學生帶動和指導未參賽學生的形式，在3周的《環(huán)境監(jiān)測與治理綜合實訓》課程時間內(nèi)把平臺操作與計算推廣到全年級學生，從而惠及全年級學生，讓所有學生公平地享受教育資源。這既是教育的初衷，也是“以賽帶教、以賽促教”的重要體現(xiàn)。

2008 年 Ma等[18]報道了交替假單胞菌Pseudoalteromonas elyakovii產(chǎn)褐藻膠裂解酶在大腸桿菌中的表達，該重組酶的部分酶學性質(zhì)見表1，該酶在工程菌大腸桿菌中的表達水平高于 P. elyakovii 39.6倍，粗酶液酶活力為310 U/mg (還原糖法測定)。經(jīng)Sephadex G-75和DEAE-FF純化后的酶活力為1 009 U/mg。來自Pseudoalteromonas sp. CY24[19]的褐藻膠裂解酶在pH 10.6范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定的活性，0.1 mol/L NaCl可使酶表現(xiàn)最高酶活。Na+、K+、Ca2+和Mg2+可以提高酶活水平。以上兩種產(chǎn)自交替假單胞菌屬的褐藻膠裂解酶均具有廣泛的底物特異性。

鏈霉菌 Streptomyces sp. A5[21]產(chǎn)褐藻膠裂解酶經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE-cellulose色譜和Sephadex G-100色譜純化，得到比活力為101.6 U/μg的純化酶，可被0.05 mol/L SDS和2 mmol/L Hg2+、Cu2+和Fe3+抑制，但EDTA卻能提高該酶的活力水平。該酶制備的褐藻膠寡糖片段具有促進香蕉苗根部生長的作用。Kim等[22]2009年報道了海洋細菌Streptomycessp. ALG-5的重組褐藻膠裂解酶，經(jīng)Ni-Sepharose親和色譜純化得到該重組酶，并對其降解產(chǎn)物的二糖、三糖、四糖和五糖純化及質(zhì)譜分析。這 2種產(chǎn)自鏈霉菌屬的酶具有相同的pG降解專一性。

表1 不同來源的褐藻膠裂解酶的部分酶學性質(zhì)Table 1 Characterization of alginate lyases from different microorganisms

Song等[39]2003年報道了弧菌Vibrio sp. QY101產(chǎn)褐藻膠裂解酶，經(jīng)陰離子交換色譜和凝膠色譜分離純化得到39 kDa的單一酶，該酶在0~30 ℃、pH 6.5~8.5范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，0.5 mol/L NaCl、1.0 mmol/L Ca2+或者5.0 mmol/L Mn2+可以促進酶活的增加，而5.0 mmol/L Ni2+、1.0 mmol/L Fe2+或1.0 mmol/L EDTA抑制酶活。底物特異性研究初步表明該酶作用于pM和pG底物，具有廣泛的底物特異性，但是沒有有關酶活力的報道。2006年該研究小組[5]報道了來自Pseudomonas sp. QD03編碼褐藻膠裂解酶的基因 algL在 pET24a(+)/E. coli BL21中表達一種新的高活性降解細菌褐藻膠的裂解酶，基本酶學性質(zhì)見表1。AlgL以褐藻酸鈉為底物時酶活為188.5 U/mg，來自銅綠假單胞菌P. aeruginosa FRD1的乙?；衷迥z為底物時酶活為158.3 U/mg，M 片段為底物時為 197.9 U/mg。而來自 Vibrio sp. QY101的AlyVI卻表現(xiàn)出pG特異性，對pM及乙?；暮衷迥z沒有作用。此外，P. aeruginosa 產(chǎn)M特異性裂解酶對乙?；潭冗_到 10%的褐藻膠沒有活性，而Pseudomonas sp. QD03產(chǎn)AlgL對54%乙?；暮衷迥z顯示高活性，這一活性與對 M片段的活性相當，文章提示該酶可作為治療銅綠假單胞菌感染的囊中纖維化病的一種輔助治療藥物。該研究小組在 2009 年[19]又報道了海洋細菌Pseudoalteromonas sp. CY24中褐藻膠裂解酶編碼基因 alyPI在大腸桿菌中的表達，AlyPI經(jīng) Ni-Sepharose親和色譜純化，確定其分子量為60 kDa，基本酶學性質(zhì)見表1。Na+、K+、Mn2+、Ca2+和Fe3+等離子的存在可以促進酶活。AlyPI酶表現(xiàn)為pM、pG和褐藻膠降解能力，具有廣泛的底物特異性。

2006?2007年，分離自弧菌Vibrio sp. 510-64[38]、Vibrio sp. YWA[40]和Vibrio sp. YKW-34[41]的褐藻膠裂解酶相繼被報道，部分酶學性質(zhì)見表1。

Vibrio sp. 510-64產(chǎn)褐藻膠裂解酶發(fā)酵液酶活力可達41 EU/mg (還原糖法)，純化后酶活力為1 666.67 U/mg (紫外法)。研究表明，50 mmol/L的Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和 K+可提高該酶的酶活。Vibrio sp. YWA 產(chǎn)褐藻膠裂解酶的酶活力較低，僅為5.6 U/mg。Vibrio sp. YKW-34產(chǎn)褐藻膠裂解酶具有Na+-K+依賴性，該酶的發(fā)酵液酶活為148 U/mg，純化酶酶活力達3 731 U/mg。

迄今為止，大約有20個來自細菌的編碼褐藻膠裂解酶的基因被克隆和測序。來自Sphingomonas sp. A1[4,27]的 A1-I 至 A1-IV、 Pseudomonas sp. OS-ALG-9[9]、丁香假單胞菌 Pseudomonas syringae pv. syringae[10]、Pseudoalteromonas elyakovi[18]、Streptomyces sp. ALG-5[22]和P. elyakovii IAM[23]等的酶基因均表達于大腸桿菌細胞中。其中 A1-IV在大腸桿菌中的表達量為8.6 U/L (培養(yǎng)液)，是原始菌株表達水平的 270倍。A1-I在大腸桿菌中的表達量為3 500 U/L，是在Sphingomonas sp. A1中的10倍。2007年發(fā)現(xiàn)P. elyakovii IAM產(chǎn)褐藻膠裂解酶在大腸桿菌中的表達量可因鈣離子的調(diào)節(jié)而提高[45]。

7 褐藻膠裂解酶的應用及前景

褐藻膠裂解酶因其降解褐藻膠獲得具有生物活性的寡糖而備受人們的青睞，來自P. elyakovii的褐藻膠裂解就已成功應用于對于特殊食品產(chǎn)品有特殊作用的褐藻寡糖的生產(chǎn)[45]。近些年除了對其降解產(chǎn)物的活性研究以外，其應用研究也包括作為海藻解壁酶獲得原生質(zhì)體、輔助提取海藻DNA、降解海藻廢物并再利用[46-48]等。

目前已有各種來源的 50多種褐藻膠裂解酶被分離并得到純化。有關褐藻膠裂解酶早期的工作主要描述其特性并通過酶的特異性應用于褐藻膠多糖結(jié)構(gòu)分析研究。近年來的研究重點轉(zhuǎn)向酶的構(gòu)效關系研究和降解產(chǎn)物的生物學研究。同時分子生物學技術(shù)的發(fā)展使得多種褐藻膠裂解酶基因得到克隆、測序并在工程菌中過量表達，這些研究工作都將為實現(xiàn)褐藻膠裂解酶向商業(yè)酶轉(zhuǎn)化并大量應用于工業(yè)中奠定重要的研究基礎，而大量的褐藻膠裂解酶或酶與底物復合物的晶體結(jié)構(gòu)的獲得將為人們不斷深入認識褐藻膠裂解酶的作用機制并利用其特性在藥物分子設計的進一步應用中奠定基礎。

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Advances in algae toolenzymes: alginate lyases

Liyan Li1, Huashi Guan1, Xiaolu Jiang1,2, and Jianjun Hao2

1 College of Medicine and Pharmaceutics, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
2 College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China

Marine can be considered as a rather unexplored source of biological material. Production of algal oligosaccharides by using valuable enzymes from marine origin has become an important way to utilize marine resources. As one of algal tool enzymes, the use of alginate lyases has been focused mainly on development and application of alginate oligosaccharides with bioactive function in recent years. In this paper, we reviewed the research of alginate lyases over the past decade in several aspects, including their origin, diversity, substrate specification, mode of action, structure and catalysis mechanism, assay of enzyme activity, enzyme characterization, as well as our own experience on this subject. At the end of the review, the application prospects of alginate lyases are presented.

alginate, alginate lyase, mannuronic acid, guluronic acid, oligosaccharide

海洋是一個巨大的資源寶庫，又是一個潛力巨大的天然藥源。PPS (藻酸雙脂鈉)、海立特等海洋藥物的問世無疑極大地鼓舞了科學工作者們向海洋要寶的信心。褐藻膠作為源自褐藻植物細胞壁的水溶性酸性多糖，在食品、醫(yī)藥和化工等領域具有廣泛的應用價值，而褐藻膠降解產(chǎn)物因其具有特殊的化學特性和生物活性，近年來成為一種新的潛在的功能產(chǎn)品不斷受到人們的關注，其功能評價和開發(fā)研究得到不斷深入，活性及藥用價值研究已經(jīng)成為新的熱點。褐藻寡糖的酶法降解制備方法因其諸多優(yōu)勢代替化學降解已經(jīng)成為一種必然。因此，作為一種海藻工具酶，褐藻膠裂解酶的研究對于推動褐藻寡糖的進一步開發(fā)有著深遠的意義和應用價值。自1968年Kaiser等[1]首次報道分離自梭菌Clostridium alginolyticum的胞外褐藻膠裂解酶以來，對褐藻膠裂解酶的研究取得了長足的發(fā)展。本文從褐藻膠裂解酶的分類和來源、酶的性質(zhì)、底物作用方式、酶活力及結(jié)構(gòu)和機理等方面，結(jié)合我們的研究工作綜述近十年來褐藻膠裂解酶的研究進展。

November 19, 2010; Accepted: January 26, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30901122).

Xiaolu Jiang. Tel: +86-532-82032290; Fax: +86-532-82032389; E-mail: jiangxl@ouc.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 30901122) 資助。