亓燕紅，鄒竹榮，鄒華英，范云六，張春義

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，泰安 271000

2 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650092

3 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 院辦檔案科，昆明 650231

4 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

在真核生物泛素家族成員中，SUMO (Small ubiquitin-related modifier，小泛素相關(guān)修飾物) 具有多種重要的生物學(xué)功能。SUMO化修飾介導(dǎo)靶蛋白分子定位和功能調(diào)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等方面均發(fā)揮著重要作用[1-2]。

近年來(lái)，SUMO作為N端融合標(biāo)簽在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到越來(lái)越多的應(yīng)用[3-8]。SUMO標(biāo)簽不僅能有效提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平和可溶性[5]，而且整體作為一個(gè)空間結(jié)構(gòu)上的識(shí)別位點(diǎn)，被其特異性蛋白酶 Ulp1從融合表達(dá)蛋白上定位 (SUMO末端二甘氨酸，-GG基序的后隨肽鍵上) 切除[3,9]，不存在任何非特異性酶切，目標(biāo)蛋白上可以不留任何殘基，這對(duì)生產(chǎn)具有天然氨基酸序列的重組蛋白極其適用。另外，Ulp1不僅酶切效率高，而且在較廣范圍的pH和溫度條件下都具有活性[3]，這相比其他切除標(biāo)簽、依賴(lài)識(shí)別序列的工具蛋白酶 (如Factor Xa、煙草蝕刻病毒蛋白酶 TEV、腸激酶 EK) 都具有顯著的綜合優(yōu)勢(shì)。類(lèi)似的泛素 (Ubiquitin) 融合系統(tǒng)雖然具備 SUMO融合系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)[3,10]，但切除泛素標(biāo)簽的去泛素化酶DUBs不穩(wěn)定，難以生產(chǎn)和廉價(jià)制備[3]；而且大腸桿菌中存在一種內(nèi)源性泛素蛋白酶 ElaD，特異性切割泛素融合蛋白，使得泛素標(biāo)簽作用失去意義[11]。因此，SUMO融合技術(shù)已成為目前大腸桿菌重組蛋白表達(dá)和純化的重要手段。

盡管如此，SUMO融合系統(tǒng)在載體構(gòu)建效率和蛋白可溶性等方面仍有待改進(jìn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)釀酒酵母SUMO基因Smt3(Sm) 具有組成型原核啟動(dòng)子活性。利用此特性，結(jié)合引入Sm 3′末端StuⅠ位點(diǎn)以及His標(biāo)簽和超酸增溶標(biāo)簽，構(gòu)建了基于 Sm’-LacZα融合基因的系列通用克隆表達(dá)載體。通過(guò)多個(gè)基因克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在改良的SUMO融合系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)載體的快速構(gòu)建和蛋白高可溶性表達(dá)，一同建立的共表達(dá)載體系統(tǒng)還可以用作研究細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株 DH5α、BL21(DE3) 以及pUC19、pET32a(+)、pACYC184和pEGFP-N1等質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，本工作中所建載體以外的其他載體均為本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建和保存。限制性內(nèi)切酶、pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和 DNA marker購(gòu)自MBI Fermentas公司；DNA快速純化回收試劑盒和蛋白分子量marker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素 (Amp)、氯霉素 (Cm)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 為Genview公司產(chǎn)品；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本工作中所有引物 (表1) 的合成以及DNA序列分析均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建

所用基因操作方法均參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[12]。載體構(gòu)建如結(jié)果中詳述，并通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 原核啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析

在NCBI網(wǎng)站上查詢并提取各物種SUMO基因的 mRNA序列，分別對(duì)其基因編碼區(qū)序列 (CDS)通過(guò)軟莓網(wǎng)站 (www.softberry.com) 提供的原核啟動(dòng)子預(yù)測(cè)程序 BPROM 和設(shè)定的參數(shù) (LDF≥0.2指含有啟動(dòng)子) 進(jìn)行分析，得到預(yù)測(cè)原核啟動(dòng)子的強(qiáng)度 (LDF值)、?10和?35元件等信息，并通過(guò)EXCEL軟件整理分析。

1.2.3 蛋白表達(dá)及SDS-PAGE分析

將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 中，挑取單菌落37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后按照4%量接種到含相應(yīng)抗生素濃度的LB液體培養(yǎng)基中 (對(duì)pET載體單獨(dú)表達(dá)使用100 mg/L Amp，對(duì)pAY載體單獨(dú)表達(dá)使用34 mg/L Cm；對(duì)pET和pAY載體共表達(dá)使用100 mg/L Amp和34 mg/L Cm)，37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集10 mL的誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)菌培養(yǎng)液，離心后加入3 mL PBS緩沖液懸浮，并用超聲波裂解。取細(xì)胞裂解物20 μL，15 000 r/min、4 ℃離心5 min，分為上清 (S) 和沉淀 (P)，用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)生成圖形文件。

1.2.4 蛋白體外酶切反應(yīng)

將SUMO融合蛋白的pET載體表達(dá)細(xì)菌與酵母Ulp1蛋白酶的載體pET(Ulp1) 表達(dá)細(xì)菌分別按上述方法制備得到裂解物上清。兩者上清一般按體積比20∶1混勻，放置 25 ℃反應(yīng) 3 h，然后用 12% SDS-PAGE分析反應(yīng)情況。

2 結(jié)果

2.1 酵母SMUO基因Smt3具有組成型原核啟動(dòng)子活性

利用引物 SmNdFw/SmStRv擴(kuò)增釀酒酵母SUMO基因 Smt3(Sm) 的 DNA片段平末端克隆到pUC19的HincⅡ(GTCGAC) 位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，發(fā)現(xiàn)在X-gal+IPTG的LB平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落幾乎全都為藍(lán)色。經(jīng)PCR鑒定Sm的重組克隆，命名為pUC(Sm-LacZα)。

圖1 質(zhì)粒pUC19(Sm-LacZα) 中SUMO基因Smt3與LacZα融合的序列分析Fig. 1 Sequence analysis of the fusion gene of Smt3 and LacZα in plasmid pUC19 (Sm-LacZα).

通過(guò)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)Sm插入 (圖1，兩豎箭頭之間) 打斷了pUC19上LacZα的翻譯閱讀框，即由核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS(lac) [AGGA]介導(dǎo)的翻譯 (圖1)。但是，Sm的反向引物SmStRv在其3′末端 (即 -GG基序密碼子處) 引入 StuⅠ位點(diǎn) (AGGCCT)產(chǎn)生了一個(gè)經(jīng)典的RBS，即RBS(sm) [GGAGG]，同時(shí)該引物 5′端附加保護(hù)堿基對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)堿基 (-AT 3′) 與克隆位點(diǎn)HincⅡ的平末端 (5′ GAC-) 融合產(chǎn)生一個(gè)ATG密碼子，與RBS(Sm) 的間隙長(zhǎng)為7 bp，這些剛好為其下游LacZα表達(dá)提供了有效的翻譯元件 (圖 1)，從而導(dǎo)致藍(lán)色菌落形成。不過(guò)，這種翻譯模板除了由Lac啟動(dòng)子 (Plac) (圖1) 在IPTG誘導(dǎo)下產(chǎn)生的Sm-LacZα轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，會(huì)不會(huì)在Sm上存在其他啟動(dòng)子產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并由 RBS(sm) 介導(dǎo)翻譯LacZα呢？

通過(guò)對(duì) Sm(306 bp) 進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn) Sm存在依賴(lài)σ70的原核啟動(dòng)子 Psm，包含?35(Psm)、?10(Psm) 元件，分別為 TTAAGA、TATTAGAAT (其后面6 bp為核心序列) (圖1)，可能引導(dǎo)下游LacZα表達(dá)。由于受固有Lac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄干擾，這種預(yù)測(cè)需要進(jìn)一步證實(shí)。

隨后以 pUC(Sm-LacZα) 為模板，利用引物SmNdFw和 LZXhRv，擴(kuò)增出 Sm-LacZα片段，經(jīng)NdeⅠ和 XhoⅠ酶切，與同樣酶切的 pET32a(+) 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，發(fā)現(xiàn)在X-gal+IPTG的LB平板上也能長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而且經(jīng)鑒定全都為陽(yáng)性克隆，取名pET(Sm-LacZα)。由于pET32a(+) 使用依賴(lài)噬菌體 T7 RNA聚合酶的 T7啟動(dòng)子 (后隨LacO序列)，DH5α和載體自身不表達(dá)T7 RNA聚合酶，因而即便存在 IPTG也不會(huì)由 T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄Sm-LacZα，那么這個(gè)導(dǎo)致藍(lán)色菌落形成的LacZα表達(dá)唯獨(dú)可能由Sm啟動(dòng)子Psm的作用所致。

另外，以pEGFP-N1為模板，利用引物GFPfw和GFPrv擴(kuò)增GFP (綠色熒光蛋白基因) 編碼區(qū)片段，分別平端插入到 pET(Sm-LacZα) 的 StuⅠ和Ecl136Ⅱ位點(diǎn) (圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落 PCR 鑒定正確陽(yáng)性克隆pET(Sm-GFP) stu和pET(Sm-GFP) ecl。GFP片段在兩個(gè)位點(diǎn)的插入都導(dǎo)致其后面的LacZα不表達(dá)，形成白色菌落。分別挑取 2種白菌落劃線在普通 LB平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)pET(Sm-GFP) ecl的菌落逐漸變成綠色，而pET(Sm-GFP) stu的菌落顏色則沒(méi)什么變化。通過(guò)序列分析，GFP在兩個(gè)位點(diǎn)的插入都與其5′端Sm形成一個(gè)正確閱讀框的融合基因，而且都有可能由Sm啟動(dòng)子引導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。但是，在StuⅠ位點(diǎn)插入導(dǎo)致RBS (sm) (圖1) 與GFP起始密碼子ATG緊密相鄰，GFP不能在此處翻譯；而在Ecl136 II位點(diǎn)插入則可以通過(guò)RBS (sm) 和其后的ATG翻譯出GFP蛋白并累積，使pET(Sm-GFP) ecl菌落逐漸變成綠色。這表明在誘導(dǎo)物IPTG不存在的情況下，Sm啟動(dòng)子能夠組成型發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，疊加在 StuⅠ位點(diǎn)的 RBS(sm) 是其下游基因翻譯的重要功能元件。總之，上述結(jié)果表明酵母SMUO基因Smt3具有明顯的組成型原核啟動(dòng)子活性。

2.2 不同物種SUMO基因的原核啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析

SMUO是真核生物中廣泛存在的一類(lèi)蛋白，釀酒酵母SUMO基因Smt3具有原核啟動(dòng)子活性，我們推測(cè)其他物種的SUMO基因可能具有同樣特性。

通過(guò)軟莓程序BPROM對(duì)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中幾乎所有的SUMO基因編碼區(qū) (CDS) 進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)121個(gè)被測(cè)對(duì)象中約90%都具有原核啟動(dòng)子活性 (LDF≥0.2)，在不同范圍 LDF值的SUMO CDS的比例依次為3% (＞5)、4% (4~5)、9% (3~4)、19% (2~3)、38% (1~2) 和17% (0.2~1) (圖2)。進(jìn)一步將不同SUMO CDS按物種劃分成4類(lèi)：真菌 (Fungi)、植物 (Plant) (絕大多數(shù)為被子植物)、無(wú)脊椎動(dòng)物 (Invertebrate) 和脊椎動(dòng)物(Vertebrate)，然后分類(lèi)統(tǒng)計(jì)它們?cè)诓煌琇DF范圍所占比例。結(jié)果顯示，真菌和植物中 85%的 SUMO CDS具有原核啟動(dòng)子活性，而在脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物中這個(gè)比例高達(dá)95%。LDF＞3的SUMO CDS在各類(lèi)物種所占比例分別為30% (真菌)、18% (植物)、27% (無(wú)脊椎動(dòng)物) 和2% (脊椎動(dòng)物)，說(shuō)明除脊椎動(dòng)物外其他物種的 SUMO CDS有較大比例具有較高的原核啟動(dòng)子活性，尤其在真菌和無(wú)脊椎動(dòng)物中表現(xiàn)更為突出，LDF＞4的比例分別為19%和16% (圖2)。

2.3 基于Sm’-LacZα融合基因的通用克隆表達(dá)載體構(gòu)建及其特性分析

圖2 含某指定范圍預(yù)測(cè)啟動(dòng)子LDF值的SUMO基因CDS在同類(lèi)物種中所占比例Fig. 2 Percentages of SUMO CDSs with indicated range of LDFs of the predicted promoters in the same category of species.

以 pET(Sm-LacZα) 為模板，使用引物對(duì)HSNdFw/SmNsRv和LZNsFw/LZXhRv，通過(guò)引物重疊延伸法[13]合成新的融合基因片段 Sm’-LacZα。通過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ酶切，與同樣酶切的pET32a(+) 連接，構(gòu)建成pET(Sm’-LacZα) (圖3A)。Sm’是由引物HSNdFw使Sm 5′端加上了一個(gè)His標(biāo)簽序列 (H6)，有利于表達(dá)蛋白純化；同時(shí)在 Sm’-LacZα融合處又引入了NcoⅠ和SalⅠ/HincⅡ位點(diǎn)，使得該處多克隆位點(diǎn) (MCS) 數(shù)目更多，便于目的基因 (如TEV) 多種形式克隆和表達(dá)。在Sm 3′末端 -GG基序密碼子處，引入了一個(gè)StuⅠ位點(diǎn)下劃線代表-GG基序密碼子，代表Ulp1切點(diǎn)；大寫(xiě)序列 AGGCCT代表 StuⅠ位點(diǎn)，代表平末端切點(diǎn)) (圖1、圖3A)，該酶切平末端5′-Sm’ ggAGG-3′能與任何靶蛋白編碼序列 target的 PCR產(chǎn)物 5′-N target-3′ (在target 5′端僅需通過(guò)PCR引物添加任何一種堿基N，表1) 連接，即可得到正確閱讀框的Sm’-target融合基因 (即5′-Sm’ ggAGGNtarget-3′)，融合表達(dá)蛋白剛好在-GG基序 (由ggAGGN 編碼)后被 Ulp1酶切開(kāi)，不會(huì)殘留任何氨基酸在靶蛋白的N端。由于Sm標(biāo)簽還只能相對(duì)有限地提高靶蛋白的可溶性[7-8]，我們分別將超酸增溶標(biāo)簽 Msb (E. coli msyB)、Yd (E. coli yjgD)、Od (E. coli rpoD的N端結(jié)構(gòu)域)[7-8]的PCR產(chǎn)物用NdeⅠ酶切，然后插入到pET(Sm’-LacZα) 的NdeⅠ位點(diǎn) (圖3A)，構(gòu)建成通用增溶表達(dá)載體 pET(MsbSm’-LacZα)、pET(YdSm’-LacZα) 和pET(OdSm’-LacZα)，超酸標(biāo)簽Msb、Yd、Od與Sm’分別形成復(fù)合超酸增溶標(biāo)簽MsbSm’、YdSm’和OdSm’。由于Sm原核啟動(dòng)子活性，所有這些載體的大腸桿菌 DH5α轉(zhuǎn)化菌落在X-gal+IPTG平板上都呈現(xiàn)藍(lán)色?？傊@些載體組成的改良SUMO融合系統(tǒng)理論上不但通過(guò)藍(lán)白斑篩選非常便于目的基因PCR產(chǎn)物的快速克隆和蛋白可溶性表達(dá)，而且尤其適合含天然氨基酸序列靶蛋白的重組生產(chǎn)。

此外，用引物PayFw和PayRv擴(kuò)增低拷貝型質(zhì)粒 pACYC184[14]，得到去除四環(huán)素抗性基因的大片段，然后用EcoR V酶切，與上面Sm’-LacZα融合基因 PCR片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落 PCR鑒定構(gòu)建了重組質(zhì)粒pAY(Sm’-LacZα) (圖 3B)。與載體 pET(Sm’-LacZα)一樣，它也可以通過(guò)藍(lán)白斑篩選用作目的基因片段(如Ulp1) 的快速克隆和表達(dá)。由于pAY(Sm’-LacZα)派生載體含pACYC184的復(fù)制起始區(qū)p15A，與其他類(lèi)型如pET(Sm’-LacZα) 派生載體 (含 ColEI復(fù)制起始區(qū)) 相容，兩者可在同一細(xì)菌中共表達(dá)，可以用于兩個(gè) (或幾個(gè)) 表達(dá)靶蛋白的相互作用分析。

圖3 載體pET(Sm’-LacZα) (A) 和pAY(Sm’-LacZα) (B) 示意圖Fig. 3 Diagrams of vectors pET(Sm’-LacZα) (A) and pAY(Sm’-LacZα) (B).

2.4 基于 pET(Sm’-LacZα) 系列的基因表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白表達(dá)分析

根據(jù)上述 pET(Sm’-LacZα) 系列載體的特性，分別利用引物對(duì) GfpFw/GfpRv、Et1Fw/Et1Rv、TevFw/TevRv、EkFw/EkRv從pET(GFP)、pET(Et1)、 pET(EK)、pET(TEV) 擴(kuò)增出靶蛋白 GFP、Et1 (TEL-SAM，轉(zhuǎn)錄抑制因子TEL的N端SAM結(jié)構(gòu)域)、EK、TEV的基因片段，插入到載體的StuⅠ位點(diǎn)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，依次得到重組質(zhì)粒 pET(Sm’-GFP)、pET(MsbSm’-GFP)、 pET(Sm’-Et1)、pET(YdSm’-Et1)、pET(OdSm’-Et1)、pET(Sm’-EK)、pET(MsbSm’-EK)、pET(YdSm’-EK)、pET(OdSm’-EK)、pET(Sm’-TEV)、pET(MsbSm’-TEV)、pET(YdSm’-TEV) 和pET(OdSm’-TEV)。

通過(guò) IPTG誘導(dǎo)，這些載體都獲得了很好地表達(dá)，融合表達(dá)蛋白的可溶性與其對(duì)應(yīng)的非融合表達(dá)靶蛋白相比都不同程度地獲得了提高。其中，Sm’ 能輕微增強(qiáng)蛋白可溶性，但其各種復(fù)合超酸增溶標(biāo)簽(MsbSm’、YdSm’、OdSm’) 的增溶效果則極其顯著(圖4)，這與我們先前工作報(bào)道的結(jié)論一致[7-8]。

將每個(gè)高可溶性表達(dá)融合蛋白的細(xì)菌裂解物上清分別與表達(dá) Ulp1酶的細(xì)菌裂解物上清進(jìn)行體外反應(yīng)，經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)這些含Sm的融合蛋白都能與Ulp1很好地反應(yīng)，Sm’及其各種復(fù)合標(biāo)簽 (MsbSm’、YdSm’、OdSm’) 都能有效地從融合蛋白上切離，并得到相應(yīng)的靶蛋白產(chǎn)物 (GFP、Et1、EK、TEV) (圖5)，這說(shuō)明Sm的N端附加蛋白序列并不影響 Ulp1對(duì)它的特異性酶切，而且也證實(shí)Ulp1酶的反應(yīng)條件非常溫和[3,8]，在細(xì)菌 PBS裂解上清中都有很好的活性。這種SUMO/Ulp1體外反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)分析不同標(biāo)簽對(duì)靶蛋白的增溶作用機(jī)理[8]。另外，這類(lèi)融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物如果通過(guò) His標(biāo)簽親和層析純化，然后與純化的 Ulp1酶體外反應(yīng)，將能夠有效地制備各種所需的靶蛋白 (尤其是含天然氨基酸序列的功能蛋白)，與我們以前報(bào)道的脂聯(lián)素結(jié)果一致[15]。

圖4 SDS-PAGE分析各種表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3) 中的表達(dá)Fig. 4 Expression of various constructs in E. coli BL21(DE3) analyzed by SDS-PAGE. O indicates the expressed target protein in non-fusion or fusion form; S: supernatant of the cell lysate; P: pellet of the cell lysate.

圖5 SDS-PAGE分析Sm融合蛋白與Ulp1表達(dá)細(xì)菌的裂解物上清體外酶切反應(yīng)Fig. 5 In vitro enzymatic reactions of the supernatants of cell lysates of Sm fusion proteins and Ulp1, analyzed by SDS-PAGE. Oindicates Sm fusion protein; * indicates target protein; > indicates Sm’ or its combinatorial tag (e.g. YdSm’); indicates Ulp1 overused in some reactions.

2.5 基于 pAY(Sm’-LacZα) 的基因表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白表達(dá)分析

基于上述 pAY(Sm’-LacZα) 的特性，根據(jù)需要可以快速簡(jiǎn)便地將不同目的基因片段克隆到該質(zhì)粒的MCS上 (圖3B)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定得到重組質(zhì)粒。

當(dāng)需要誘導(dǎo)型表達(dá)時(shí)，可以將目的基因表達(dá)盒 (誘導(dǎo)型啟動(dòng)子+目的基因+轉(zhuǎn)錄終止子) 插入到MCS上的任何單一酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用引物對(duì)Pt7Fw/Tt7Rv，分別以pET(Et1)、pET(Et1-GFP)、pET(YA)、pET(MST) 為模板，擴(kuò)增其對(duì)應(yīng)基因表達(dá)盒片段Pt7_Et1_Tt7、Pt7_Et1-GFP_Tt7、Pt7_YA_Tt7、Pt7_MST_Tt7 (Pt7為t7啟動(dòng)子，Tt7為t7轉(zhuǎn)錄終止子，位于pET載體上，圖3A)。將這些PCR片段分別平末端克隆在pAY(Sm’-LacZα) 的MCS內(nèi)HincⅡ位點(diǎn) (可以選擇其他平末端酶位點(diǎn)如 StuⅠ、SmaⅠ和Ecl136Ⅱ)，構(gòu)建成載體pAY(Et1)、pAY(Et1-GFP)、pAY(YA) 和pAY(MST)。如同pET系列載體一樣，它們都是受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在不加IPTG的情況下，Pt7不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，同時(shí)由插入片段上游Sm啟動(dòng)子Psm起始的轉(zhuǎn)錄遇到 Pt7后 LacO序列時(shí)也會(huì)被阻斷，因而沒(méi)有目的基因表達(dá)產(chǎn)物；當(dāng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)，這些pAY載體都能很好地表達(dá) (圖6)。由于pAY載體與 pET載體使用不同的復(fù)制起始區(qū) (p15A、ColEI)，因而能夠相容于同一細(xì)菌中共表達(dá)。分別將pET(EY)/pAY(Et1)、 pET(EY)/pAY(Et1-GFP)、pET(Trx-Ab)/pAY(YA)、pET(Ab-GFP)/pAY(YA)、pET(TEV)/pAY(MST) 進(jìn)行共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后所有目的基因都不同程度地獲得高水平表達(dá) (圖6)，這種共表達(dá)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)研究?jī)?(幾) 個(gè)關(guān)聯(lián)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。此外，所有pAY載體在任何情況下都有一條明顯的 Cm抗性基因 (CmR) 表達(dá)條帶 (圖6)，這可能與CmR上游組成型啟動(dòng)子活性密切相關(guān)。

圖6 SDS-PAGE分析派生于pAY(Sm’-LacZα) 的pAY系列載體與其相關(guān)pET載體的共表達(dá)Fig. 6 Co-expressions of pAY (Sm’-LacZα)-derived pAY vectors and their correlated pET vectors, analyzed by SDS-PAGE. O indicates the recombinant protein expressed from pET vector; * indicates the recombinant protein expressed from pAY vector; > indicates the protein product of CmR (chloramphenicol acetyltransferase).

當(dāng)需要組成型表達(dá)時(shí)，可以將目的基因編碼區(qū)插入在pAY(Sm’-LacZα) MCS的NcoⅠ后面任何單一酶切位點(diǎn) (圖3B)，并使基因翻譯閱讀框從NcoⅠ上的 ATG密碼子開(kāi)始，這樣目的基因就可以由Sm啟動(dòng)子Psm組成型轉(zhuǎn)錄，并由RBS(sm) 和其后NcoⅠ上 ATG密碼子介導(dǎo)翻譯 (圖1)。在一些細(xì)菌體內(nèi)共表達(dá)分析系統(tǒng)中，某種蛋白 (如工具酶) 并不需要高水平的表達(dá)，這樣有必要選擇普通啟動(dòng)子而不是強(qiáng)啟動(dòng)子如 Pt7?；诖?，我們利用引物對(duì)Ulp1Fw/ Ulp1Rv從 pET(Ulp1) 模板中擴(kuò)增出 Ulp1片段，插入到pAY(Sm’-LacZα) 的HincⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建了 Ulp1組成型表達(dá)載體 pAY(c-Ulp1) (c-代表由Sm啟動(dòng)子介導(dǎo)的組成型表達(dá))，并與上述含Sm標(biāo)簽的pET系列載體如pET(YdSm’-Et1) 共表達(dá)，體內(nèi)分析標(biāo)簽對(duì)靶蛋白的作用，得到的結(jié)果 (未顯示) 與我們先前報(bào)道的一致[8]。

3 討論

近年來(lái)，SUMO融合技術(shù)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到越來(lái)越多的應(yīng)用，但仍處在不斷的改進(jìn)中[3-8]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)酵母SUMO基因Smt3 (Sm)具有組成型原核啟動(dòng)子活性，包含明顯的?35、?10特征序列 (圖1)。而且，通過(guò)軟莓BPROM程序預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)物種SUMO基因編碼區(qū)普遍都具有依賴(lài)σ70的原核啟動(dòng)子，但活性存在較大差異 (圖2)，這種現(xiàn)象可能與SUMO基因作為直向同源基因(Ortholog) 在不同類(lèi)物種的進(jìn)化程度相關(guān)。

利用SUMO標(biāo)簽本身特點(diǎn)及Sm內(nèi)含原核啟動(dòng)子特性，通過(guò)在Sm 3′末端 (-GG基序密碼子處) 引入StuⅠ位點(diǎn)和進(jìn)一步在Sm的5′端附加His標(biāo)簽和超酸增溶標(biāo)簽 (Msb、Yd、Od)，我們構(gòu)建了基于Sm’-LacZα融合基因和 pET32a(+) 背景的系列通用克隆表達(dá)載體 (圖3A)，并由多個(gè)基因克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)得到檢驗(yàn) (圖 4、5)。由此組成的改良 SUMO融合系統(tǒng)集成了諸多特性，如通過(guò)藍(lán)白斑篩選快速構(gòu)建基因表達(dá)載體、SUMO和超酸增溶標(biāo)簽促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)、SUMO/Ulp1反應(yīng)系統(tǒng)制備任何含天然氨基酸序列的靶蛋白、利用His標(biāo)簽純化表達(dá)蛋白、以及pET系統(tǒng)固有的蛋白高水平表達(dá)等等，因此可以成為大腸桿菌重組蛋白表達(dá)的有力工具；與另一改良的SUMO融合系統(tǒng)[6]相比，在某些方面可能更具優(yōu)勢(shì)。

另外，我們還構(gòu)建了基于Sm’-LacZα融合基因、派生于質(zhì)粒pACYC184 (低拷貝、含p15A復(fù)制起始區(qū)) 的通用克隆表達(dá)載體pAY(Sm’-LacZα) (圖3B)。通過(guò)藍(lán)白斑篩選鑒定，由此按需構(gòu)建的pAY系列目的基因表達(dá)載體可以進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)或與其他含不同復(fù)制起始區(qū) (如ColEI) 的質(zhì)粒表達(dá)載體如pET系列共表達(dá) (圖 6)、組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)，以用于蛋白研究的不同用途如分析細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用關(guān)系[8]等。

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