楊武晨，郭 紅

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是一種定植在人胃和十二指腸的微需氧、革蘭氏陰性、螺旋彎曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌，與胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的發(fā)生密切相關。近幾年的研究顯示，H.pylori感染還與缺血性心臟病、動脈粥樣硬化、缺鐵性貧血等胃外疾病相關［1］。尿素酶是H.pylori中含量最為豐富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，結(jié)構(gòu)亞單位為尿素酶A和尿素酶B。其中，尿素酶B亞單位（Urease subunit beta，UreB）為尿素酶的活性亞基，在幽門螺桿菌的致病過程中起著至關重要的作用，相對分子質(zhì)量較大，約為64 000，具有高度的保守性和免疫原性，是H.pylori最佳的疫苗候選抗原之一。

1 幽門螺桿菌疫苗研究概論

H.pylori是人類上消化道疾病的重要致病菌。1994年，世界衛(wèi)生組織已將其列為人群第一類致癌因子［2］。目前，臨床上主要是通過“三聯(lián)”或“四聯(lián)”療法來對H.pylori感染的患者進行根除治療，但因藥物的副作用大，患者的依從性差，耐藥菌株的逐漸增加，使其應用受到了較大的限制。且根除治療并不能預防H.pylori的感染與根除后再感染。幽門螺桿菌疫苗能誘發(fā)機體的特異性免疫應答清除感染，又可激發(fā)機體的免疫記憶來預防再次感染，且副作用少。因此，自從幽門螺桿菌被發(fā)現(xiàn)之后人們便廣泛開展其疫苗的研究［3］?，F(xiàn)有疫苗主要有以下幾種形式：

①全菌滅活疫苗——較為傳統(tǒng)的疫苗 其抗原成分較為復雜，包含了H.pylori的所有抗原成分，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生高效的免疫應答。但是，特異性不高、副作用較大、易發(fā)生交叉免疫反應，不適用于人體接種，具有一定的局限性。

②亞單位疫苗——疫苗研究的重點 其抗原成分具有較全菌疫苗的簡單、成分清楚、安全性好、特異性強等優(yōu)點。常見的亞單位疫苗的抗原主要包括：尿素酶及其B亞單位（UreB）、細胞毒素相關蛋白A（Cag A）、粘附素（Hpa A）、熱休克蛋白（HSP）、空泡毒素（Vac A）、脂多糖（LPS）等。目前，UreB作為抗原的疫苗研究較多。

③聯(lián)合疫苗/多價疫苗——兩種或多種抗原成分 使用單價疫苗存在著一定局限性，為了克服單種抗原免疫原性弱、免疫效果不強等缺點，聯(lián)合疫苗/多價疫苗可獲得比單價疫苗較好的免疫保護效果，能明顯提高動物的免疫保護率。

④核酸疫苗——第三代疫苗 較常規(guī)疫苗相比具有生產(chǎn)制備簡便、高效、廣譜、廉價、無致病性、易存儲以及能激發(fā)機體細胞和體液免疫應答等優(yōu)點。

⑤表位疫苗——疫苗發(fā)展的新方向 機體的免疫應答不是針對整個外源物質(zhì)（抗原），而僅僅只是抗原的一小段區(qū)域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制備而成的疫苗。根據(jù)抗原表位的不同，分為B細胞表位疫苗、T細胞表位疫苗和兼具有2種表位的多表位疫苗［4］。目前，UreB的B細胞表位和Th細胞表位鑒定已有文獻報道［5－6］。表位疫苗具有易于生產(chǎn)、特異性高、免疫原性強、安全性較好等特點。表位疫苗，是近年來疫苗設計的新思路，具較好的應用前景。

2 尿素酶B亞單位的主要特性

無論疫苗是什么形式，其核心仍是組成疫苗的抗原成分。尿素酶B亞單位之所以能夠成為研究最為廣泛的幽門螺桿菌疫苗抗原，與其特性密不可分。H.pylori中尿素酶是含量最為豐富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，是H.pylori重要的定植因子和毒力因子。尿素酶是一種含有Ni離子的金屬酶，活性部位的鎳離子含量決定尿素酶的活性。其由A、B 2個結(jié)構(gòu)亞單位和輔助蛋白組成［7］。Ure A與UreB結(jié)構(gòu)蛋白，主要功能是通過水解尿素生成氨和二氧化碳來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外或/和周質(zhì)的p H值，保護H.pylori抵抗胃酸的作用，促使菌體定植于胃黏膜，在菌體致病過程中發(fā)揮著重要作用。

UreB缺乏尿素酶的全酶活性，具有無毒性和較高的免疫原性，能有效誘導機體的免疫保護作用，相對分子質(zhì)量較大，約為64 000。不同H.pylori菌株間UreB核酸序列有高度的同源性，高度保守，用UreB作為免疫原具有較高的穩(wěn)定性。實驗證實，UreB比尿素酶的另一結(jié)構(gòu)亞單位Ure A具有較好的免疫保護性。目前，大量的動物實驗已經(jīng)證明尿素酶B亞單位具有免疫預防和免疫治療的作用，安全性和有效性進一步得到了驗證。尿素酶B亞單位是H.pylori的主要特異性抗原，直接從H.pylori菌株中分離UreB的量少，而通過基因重組技術(shù)來制備大量的UreB，為建立特異性的UreB疫苗奠定基礎。因此，常把尿素酶B亞單位作為疫苗設計的最佳候選抗原。

3 尿素酶B亞單位的疫苗研究進展

3.1 UreB的亞單位疫苗/多價疫苗 過氧化氫酶和尿素酶B亞單位加免疫佐劑組成的二價口服疫苗較單價口服疫苗有更好的預防C57BL/6小鼠感染人類幽門螺桿菌（H.pylori）的作用，保護免疫率達到83.3%（20/24）［8］。李明峰等［9］構(gòu)建表達了幽門螺桿菌的熱休克蛋白A亞單位（Hsp A）和尿素酶B亞單位（UreB）的重組蛋白質(zhì)的侯選菌株。融合蛋白免疫BALB/c小鼠，結(jié)果觀察到，免疫的小鼠血清中均可檢測到抗Hsp A和UreB的抗體，而對照組則無相應抗體。Hsp A－UreB融合蛋白有可能作為一種有效的雙價候選疫苗用于幽門螺桿菌感染的預防和治療。UreB和Hpa A雙價重組疫苗聯(lián)用，并輔以佐劑r LTB時對小鼠具有較高的免疫保護率［10］。二價或多價疫苗較單價疫苗的免疫效果強。無論是以UreB蛋白為抗原的亞單位疫苗還是與其他亞單位抗原聯(lián)合的多價疫苗，雖然都具有一定的免疫保護效果。但是，可能存在：①抗原成分復雜，特異性不高。②免疫佐劑對人體健康造成危害等問題。這就要求人們尋找更為安全有效的疫苗。3.2 UreB的核酸疫苗 曾韋錕等［11］、徐燦等［12］都從不同的H.pylori菌株中成功構(gòu)建了幽門螺桿菌UreB核酸疫苗，但是都沒有進行動物實驗去驗證其免疫原性。袁小澎等［13］擴增了幽門螺桿菌2個保護性亞單位UreB、Hsp A基因，進行基因融合，成功構(gòu)建了H.pylori雙價DNA疫苗，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生特異性抗體，顯示出良好的免疫原性。劉秀麗等［14］將H.pylori的 UreB－Hsp A融合基因成功構(gòu)建到腺病毒載體上，免疫小鼠3次，在第2次加強免疫后7 d、3次免疫后的14 d，血清抗UreB－Hsp A的IgG抗體滴度基本保持在2次免疫時的水平，抗體效價最高可達1∶2 000，新鮮糞便檢測sIg A，顯示產(chǎn)生了特異性抗體黏膜sIg A，說明重組病毒能夠激發(fā)機體UreB－Hsp A的特異性體液免疫和黏膜抗體免疫反應。但是，融合基因表達的蛋白較大，特異性不高，免疫原性不強。

3.3 UreB的表位疫苗 國內(nèi)外關于UreB的表位疫苗研究取得了一定的進展。UreB蛋白含有569個編碼氨基酸，使用全長蛋白作為疫苗研究的抗原，存在抗原表位組成成分復雜、特異性不高、免疫應答不強等局限性。如果能找到激發(fā)機體免疫應答的免疫保護性優(yōu)勢表位，即用UreB的小片段蛋白，來替代全長的UreB在疫苗中發(fā)揮作用，制備高效、特異性的表位疫苗，能激發(fā)機體較強的免疫應答，從而達到預防和根除H.pylori的感染。

目前得到的UreB表位大部分是B細胞表位。Qiu Y等［15］確定UreB的線性表位，3個B細胞線性表位的覆蓋了15個氨基酸（AA）氨基酸區(qū)域在158－172，181－195和 UreB的349－363。肽與谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合免疫小鼠，顯示抗原表位肽特異性抗體能抑制尿素酶活性。在臨床應用價值較大，這些肽作為抗原表位疫苗來治療H.pylori具有重要的意義。Li HX等［16］使用截短法分段構(gòu)建含UreB抗原的重組質(zhì)粒，用IPTG誘導表達融合蛋白，對表達產(chǎn)物進行鑒定。初步確定抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位（UreB）單克隆抗體（m Ab）6E6識別的抗原表位位于200－230位氨基酸。但是抗體在H.pylori感染的免疫保護中的作用是非必需的還是必需的目前還不確定，有研究也表明清除H.pylori感染的過程中抗體仍然具有一定的免疫保護作用。特別是抗體具有中和尿素酶的活性對于免疫保護是有利的。

研究顯示，H.pylori的免疫保護機制趨向于依賴CD4＋T細胞，而并非CD8＋T細胞的免疫反應。幽門螺桿菌表位疫苗設計前提是篩選輔助性T細胞（helper T lymphocyte，Th）表位，明確各表位激發(fā)的免疫應答特性。Shi Y等［5］通過使用RANKPEP預測獲得7條可能的H－2d限制性的Th細胞表位，其中 3 條表位肽 U546－561，U119－244，和U237－251能夠刺激r UreB致敏的 BALB/c（H－2d）小鼠的CD4＋T淋巴細胞的增殖。U546－561和U229－244能誘導Th2類型的細胞因子分泌。然而，U237－251能誘導Th1類型的細胞因子分泌。實驗證明，這些免疫優(yōu)勢表位能刺激機體產(chǎn)生特異性的免疫應答，應用于相應的表位疫苗研究能取得較好的免疫保護效應。

為了避免抗原結(jié)構(gòu)中可能存在的抑制性、致病性以及非必需表位的影響，合理組合設計具有保護性B細胞和Th細胞表位的多表位疫苗，能夠激發(fā)機體較強的特異性免疫應答。Zhou WY等［17］已經(jīng)設計和構(gòu)建了一個多表位疫苗（命名為 HUepi－LTB），包括作者前期蛋白鑒定的UreB 3個新的H－2d限制性Th表位（U546－561，U229－244，和 U237－251）、尿素酶的一個 B細胞表位 U327－334、Hpa A的一個B細胞表位（H132－141）和粘膜佐劑大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）。相對于口服PBS免疫組，多表位疫苗能顯著的降低H.pylori的定植作用，并且能產(chǎn)生抗原特異性CD4＋T細胞的應答和IgG和粘膜Ig A抗體的產(chǎn)生。

無論是哪種免疫保護機制，是核酸疫苗、亞單位疫苗還是表位疫苗，都具有各自的缺點和優(yōu)勢，其最終目的都是能夠引起機體的細胞免疫和體液免疫應答，發(fā)展更為簡便、安全和有效的疫苗，治療和預防H.pylori的感染。然而在實現(xiàn)全面、徹底、高效、預防、治療和根除H.pylori的感染和再感染方面，UreB表位疫苗則具有較好的開發(fā)應用前景。

4 展 望

隨著人們對UreB疫苗研究的不斷深入，使用UreB疫苗來根治和預防H.pylori的感染將有可能得到實現(xiàn)。UreB疫苗具有在菌體中含量豐富、特異性強等優(yōu)點；缺乏天然的蛋白天然結(jié)構(gòu)、容易引起免疫耐受、常用的佐劑可能存在潛在的毒性作用等缺點。然而，抗原通過氨基酸修飾、多表位串連展示到有效載體上，能提高其與抗體的親和力，增強抗原的免疫原性和穩(wěn)定性。

表位疫苗作為未來疫苗的發(fā)展趨勢，具有很多的優(yōu)點。如：相對于亞單位疫苗的成分簡單；相對核酸疫苗不存在潛在的威脅；特異性較其他疫苗高。表位的成功篩選和鑒定方法已經(jīng)得到廣泛的應用。從已報道的文獻來看，動物實驗結(jié)果令一些對表位疫苗感興趣的學者欣喜［18］。但是，表位疫苗的研究仍然面臨多方面的考驗：如何選擇有效的方法，篩選和鑒定有效的抗原表位成分，以此來作為疫苗的候選抗原，產(chǎn)生大量特異性抗體和淋巴細胞，提高其免疫反應性；如何選擇有效的載體分子；目前表位研究主要是在實驗小鼠上得到驗證，基于人的表位疫苗研究如何；表位疫苗在多種HLA中的限制性，在人群中的作用規(guī)律如何等等，都是人們在以后的研究中必須去關注的內(nèi)容。研究UreB表位，特別是優(yōu)勢表位，對揭示UreB的有效作用成分、闡明H.pylori疫苗的作用機理，對發(fā)展更安全有效的H.pylori疫苗具有理論指導意義。

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