楊玉霞

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京210095)

隨著人們對(duì)基因組的研究越來(lái)越深刻和全面，也就認(rèn)識(shí)到單純孤立地進(jìn)行核酸研究已不能完全解釋生命現(xiàn)象的本質(zhì)問(wèn)題，只有將對(duì)核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起進(jìn)行研究才能從根本上對(duì)生命的本質(zhì)有全面的認(rèn)識(shí)。隨著人類基因組計(jì)劃的逐步完成和后基因組時(shí)代的到來(lái)，一個(gè)新的研究領(lǐng)域——蛋白質(zhì)組的研究隨之被提出來(lái)了。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組(Proteome)，源于蛋白質(zhì)(protein)與基因(genome)2個(gè)詞的雜合，是指一種基因組或一種生物、一個(gè)細(xì)胞(組織)所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)[1](proteomics)則以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上來(lái)研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要內(nèi)容包括2個(gè)方面，即蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)的功能模式。蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)內(nèi)容，主要研究特定條件下某一細(xì)胞或組織的所有蛋白質(zhì)的表征問(wèn)題。蛋白質(zhì)的功能模式的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最終目標(biāo)，它是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深層次了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。只有在建立了蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞圖譜之后，人們才能開(kāi)始通過(guò)打斷蛋白質(zhì)間相互作用的路徑來(lái)研究細(xì)胞功能。

研究蛋白質(zhì)組的三大核心技術(shù)是雙向電泳、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)。而雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是目前唯一可將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離的方法，雙向電泳技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)被公認(rèn)為是目前蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。

2 雙向電泳技術(shù)

2.1 雙向電泳技術(shù)原理

雙向電泳技術(shù)由Farre l等人于1975年建立。其基本原理是:第1向進(jìn)行等電聚焦，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是兩性分子，具有不同的等電點(diǎn)，在pH梯度介質(zhì)中外加電場(chǎng)作用形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶;第2向根據(jù)分子量不同進(jìn)行分離。第1向等電聚焦完成后，將凝膠包埋在SDS-PAGE凝膠板上端，在垂直或水平方向進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)第2次分離，結(jié)果形成分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)[1－2]，所得蛋白質(zhì)雙維圖譜中每個(gè)點(diǎn)代表樣本中的一個(gè)或數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和在樣本中的含量也可顯現(xiàn)出來(lái)[3]

2.2 雙向電泳技術(shù)在水稻蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

水稻蛋白質(zhì)組學(xué)的兩大重要任務(wù)是:1)確定從已經(jīng)構(gòu)建的水稻cDNA文庫(kù)中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)是否能通過(guò)在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行氨基酸序列同源搜索得到證實(shí);2)預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)的功能并研究水稻功能蛋白的生理意義。隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)體系的不斷發(fā)展以及水稻基因組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷充實(shí)，一些適用于水稻蛋白質(zhì)組的研究體系正日臻完善，越來(lái)越多的水稻功能蛋白質(zhì)已得到證實(shí)[4]。

由Komat su等[5]構(gòu)建的水稻蛋白組文庫(kù)是關(guān)于水稻組織蛋白組分析的先鋒報(bào)導(dǎo)。水稻種子胚、胚乳以及葉片蛋白，經(jīng)2D2PA GE分離，考馬斯亮藍(lán)染色，在胚、胚乳和葉片中檢測(cè)到超過(guò)600、100和150個(gè)主要蛋白。Zhong等[6]分析了水稻根部總蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色后檢測(cè)到292個(gè)蛋白點(diǎn)。N2端和中間氨基酸測(cè)序分析了76個(gè)蛋白。經(jīng)同源搜索鑒定了42個(gè)蛋白。同年Hirano通過(guò)2D2PA GE技術(shù)研究了水稻種子胚、胚乳和葉、根的蛋白，總共分析了278個(gè)蛋白，4個(gè)組織中的121個(gè)蛋白的N2端和中間氨基酸序列已測(cè)出。Ramani和Apte[7]用放射性同位素自顯影雙向電泳法研究水稻幼苗鹽脅迫下多基因的瞬時(shí)表達(dá)表明，至少有35個(gè)蛋白質(zhì)被鹽脅迫誘導(dǎo)和17個(gè)蛋白質(zhì)被抑制，包括20個(gè)在這之前未曾報(bào)道的低豐度蛋白。Agrawal等[8]用2D2PA GE、氨基酸測(cè)序和免疫雜交法，首次檢測(cè)了臭氧對(duì)水稻幼苗蛋白的影響。Monowar等[9]通過(guò)2D2PA GE分離核蛋白，采用Image2 Master 2D Elite軟件分析考馬斯亮藍(lán)染色的p H4～10的膠條，有549個(gè)蛋白點(diǎn)，挑選出了257個(gè)豐度較高蛋白點(diǎn)。

2.3 雙向電泳技術(shù)的部分優(yōu)化步驟

判斷雙向凝膠電泳質(zhì)量的好壞可通過(guò)分析其圖譜而獲得。一張好的圖譜必須背景低、紋理少、分辨率高、靈敏度高，而且圖譜必須有良好的重現(xiàn)性。但是由于技術(shù)的熟練程度以及技巧掌握的不同，往往凝膠電泳圖譜存在一些問(wèn)題。下面介紹幾個(gè)關(guān)鍵步驟的優(yōu)化方案。

2.3.1 蛋白質(zhì)提取方法的優(yōu)化

不同的蛋白質(zhì)提取方法對(duì)雙向電泳的分離效果影響很大。根據(jù)不同的研究目的，應(yīng)選擇不同的蛋白質(zhì)提取方法。丁承強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)如果要研究組織中盡可能多的蛋白質(zhì)，可以選擇TCA-丙酮法(這一方法是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)提取方法)。而當(dāng)研究目的是可溶性蛋白質(zhì)時(shí)，可以使用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行提取。如果研究不同的亞細(xì)胞器，則最常使用梯度離心的方法，分別提取不同亞細(xì)胞器的蛋白質(zhì)。如果提取的組織中含有大量的糖類，可以增加乙醇/乙醚的清洗次數(shù)，這種方法得到的雙向泳圖，背景比用丙酮清洗的更加干凈。

2.3.2 上樣量的優(yōu)化

對(duì)上樣量影響最大的因素有2個(gè)，即染色方法和IPG膠條。如果采用銀染，那么上樣量通常在100～300μg;IPG膠條的pH值范圍越大，上樣量越少。上樣量增大，分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)減少;上樣量減小，膠圖背景變深。綜合比較，選擇蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多且背景較好的上樣量進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 聚焦時(shí)間的優(yōu)化

丁承強(qiáng)等[10]發(fā)現(xiàn)電泳圖中如果蛋白質(zhì)點(diǎn)的右側(cè)有明顯拖尾，左側(cè)沒(méi)有，則說(shuō)明聚焦伏小時(shí)數(shù)過(guò)多，聚焦過(guò)度，這時(shí)應(yīng)減少聚焦時(shí)間;如果蛋白質(zhì)點(diǎn)的兩側(cè)均有明顯的拖尾，則說(shuō)明聚焦伏小時(shí)數(shù)過(guò)少，沒(méi)有完全聚焦，應(yīng)增加聚焦時(shí)間。

2.4 雙向電泳技術(shù)的局限性

目前，雙向電泳技術(shù)檢測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)目比估計(jì)的細(xì)胞內(nèi)總蛋白少得多，主要原因有[3]:電泳的靈敏度不夠，一些低拷貝數(shù)蛋白檢測(cè)不到，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的拷貝數(shù)低于1 000時(shí)，雙向電泳技術(shù)是不能分辨出來(lái)的;部分蛋白(如膜蛋白)不溶于樣品緩沖液，疏水膜蛋白和大分子蛋白不易進(jìn)入凝膠的第2向;一些分子量過(guò)大、極端酸性或堿性的蛋白在電泳過(guò)程中會(huì)丟失;有時(shí)一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)含有不止一種蛋白。

樣品處理也是影響雙向電泳靈敏度的主要原因之一。雙向電泳技術(shù)具有極高的分辨率和靈敏度，可以同時(shí)顯示組織或細(xì)胞內(nèi)各種蛋白，但其重復(fù)性卻很不理想。

3 展望

蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系為人類從蛋白質(zhì)水平上揭開(kāi)生命活動(dòng)規(guī)律提供了有力的武器。雖然作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)雙向電泳技術(shù)尚未完善，手工操作較多，經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，存在許多局限性。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雙向凝膠電泳技術(shù)必將日趨完善，影響其發(fā)展的瓶頸也會(huì)得到最終解決。未來(lái)通過(guò)雙向電泳及其他技術(shù)獲得水稻全植株的蛋白質(zhì)組信息以及水稻在正常與病理，可育與不育等條件下所出現(xiàn)的關(guān)鍵的差異蛋白，可幫助人們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上充分利用水稻基因序列圖譜研究成果，更好地利用雜交優(yōu)勢(shì)[11]，建立水稻高新栽培技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化模式，最終促進(jìn)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展.

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